TRANSKRIPTOMIKAT
natyrës
KOMUNIKIMET
Karakterizimi i transkriptit të plotë të mutacionit SF3B1 në leuçeminë limfocitare kronike zbulon uljen e rregullimit të introneve të mbajtura
Transkriptet e plota|Sekuenca e nanoporeve|Analiza alternative e izoformës
Sfondi
SMutacionet omatike në faktorin splicing SF3B1 është raportuar gjerësisht se lidhen me kancere të ndryshme, duke përfshirë leuçeminë limfocitare kronike (CLL), melanomën uveale, kancerin e gjirit, etj. Përveç kësaj, studimet transkriptomike të lexuara shkurt kanë zbuluar modele aberrante bashkimi të shkaktuara nga mutacionet SF3B1.Megjithatë, studimet mbi këto modele alternative të bashkimit kanë qenë prej kohësh të kufizuara në nivelin e ngjarjes dhe mungesën e njohurive në nivelin e izoformës për shkak të kufizimit të transkripteve të mbledhura me lexim të shkurtër.Këtu, platforma e sekuencës nanopore u prezantua për të gjeneruar transkripte me gjatësi të plotë, të cilat fuqizuan inverstigimin në izoformat AS.
Dizajn Eksperimental
Eksperimentet
Grupimi:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(mutacion K700E);3. Qelizat B normale
Strategjia e renditjes:Sekuenca e bibliotekës MinION 2D, renditja e bibliotekës PromethION 1D;të dhëna të leximit të shkurtër nga të njëjtat mostra
Platforma e renditjes:ONT MinION;ONT PromethION;
Analiza Bioinformatike
Rezultatet
Agjithsej 257 milionë lexime u gjeneruan nga 6 mostra CLL dhe 3 qeliza B.Mesatarisht, 30.5% e këtyre leximeve u identifikuan si transkripte të plota.
FAnaliza e izoformave alternative me gjatësi të plotë të ARN (FLAIR) u zhvillua për të gjeneruar një grup izoformash me besim të lartë.FLAIR mund të përmblidhet si:
Nanopore lexon shtrirjen: identifikoni strukturën e përgjithshme të transkriptit bazuar në gjenomën e referencës;
Skorrigjimi i kryqëzimit të fijeve: korrigjimi i gabimeve të sekuencës (e kuqe) me vendin e bashkimit nga intronet e shënuara, intronet nga të dhënat e lexuara shkurt ose të dyja;
Ckolaps: përmblidhni izoformat përfaqësuese të bazuara në zinxhirët e bashkimit të bashkimit (seti i kalimit të parë).Zgjidhni një iso me besim të lartë bazuar në numrin e leximeve mbështetëse (Pragu: 3).
Figura 1. Analiza FLAIR për të identifikuar izoformat me gjatësi të plotë të lidhur me mutacionin SF3B1 në CLL
FLAIR Identifikoi 326,699 izoforma të bashkuara me besim të lartë, 90% e të cilave janë izoforma të reja.Shumica e këtyre izoformave të pashënuara u zbuluan se ishin kombinime të reja të bashkimeve të njohura të bashkimit (142,971), ndërsa pjesa tjetër e izoformave të reja përmbanin ose intron të mbajtur (21,700) ose ekzon të ri (3594).
Lsekuencat e leximit të gjatë fuqizon identifikimin e vendeve të ndërrimit të mutant SF3B1-K700E në nivelin e izoformës.35 alternativa 3'SS dhe 10 alternative 5'SS u gjetën se ishin të lidhura në mënyrë të konsiderueshme diferenciale midis SF3B1-K700E dhe SF3B1-WT.33 nga 35 ndryshimet u zbuluan rishtazi nga sekuenca të lexuara gjatë.Në të dhënat e Nanopore, shpërndarja e distancës midis 3'SS-ve të ndryshuara nga SF3B1-K700E deri në majat e vendeve kanonike është rreth -20 bp, e cila ndryshon ndjeshëm nga një shpërndarje kontrolli, e ngjashme me atë që është raportuar në sekuencat e leximit të shkurtër të CLL.Izoformat e gjenit ERGIC3 u analizuan, ku një izoformë e re që përmban vendin e bashkimit proksimal u gjet më e bollshme në SF3B1-K700E.Si 3'SS proksimale ashtu edhe distale u shoqëruan me modele të dallueshme AS që gjeneronin izoforma të shumta.
Figura 2. Modelet alternative të bashkimit 3' të identifikuara me të dhënat e sekuencës nanopore
Analiza e përdorimit të ngjarjeve IR ka qenë prej kohësh e kufizuar në analizat e bazuara në lexim të shkurtër për shkak të besimit në identifikimin dhe sasinë IR.Shprehja e izoformave IR në SF3B1-K700E dhe SF3B1-WT u mat në bazë të sekuencave nanopore, duke zbuluar një ulje globale të rregullimit të izoformave IR në SF3B1-K700E.
Figura 4. Intensiteti i bujqësisë dhe lidhja e rrjetit në tre sisteme bujqësore (A dhe B);Analiza e rastësishme e pyjeve (C) dhe Marrëdhënia midis intensitetit bujqësor dhe kolonizimit të AMF (D)
Figura 3. Ngjarjet e marrjes së intronit janë më të dobëta të rregulluara në CLL SF3B1-K700E
Teknologjia
Nanopore Renditja e lexuar gjatë
NSekuenca anopore është një teknologji e renditjes së sinjaleve elektrike me një molekulë në kohë reale.
DADN ose ARN me fije të dyfishtë do të lidhet me proteinën nanoporoze të ngulitur në biofilm dhe do të zbërthehet nën drejtimin e proteinës motorike.
DFijet e NA/ARN kalojnë përmes proteinës së kanalit nanopore me shpejtësi të caktuar nën veprimin e diferencës së tensionit.
Molekulat gjenerojnë sinjale të ndryshme elektrike sipas strukturës kimike.
RZbulimi në kohë reale i sekuencave arrihet me thirrjen bazë.
Performanca e sekuencës së transkriptomës me gjatësi të plotë
√ Ngopja e të dhënave
Kërkohen 7 herë më pak lexime për të arritur ngopje të krahasueshme të të dhënave.
√ Identifikimi i strukturës së transkriptit
Identifikimi i varianteve të ndryshme strukturore me konsensus lexim të plotë të secilit transkript
√ Analiza diferenciale e nivelit të transkriptit - Zbuloni ndryshimet e fshehura nga leximet e shkurtra
Referenca
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, etj.Karakterizimi i transkriptit të plotë të mutacionit SF3B1 në leuçeminë limfocitare kronike zbulon rregullimin e poshtëm të introneve të mbajtura [J].Nature Communications.
Teknika dhe Pikat kryesore synon të ndajë aplikimin më të fundit të suksesshëm të teknologjive të ndryshme të renditjes me performancë të lartë në arena të ndryshme kërkimore, si dhe idetë e shkëlqyera në dizajnimin eksperimental dhe nxjerrjen e të dhënave.
Koha e postimit: Jan-08-2022