ЉУДСКА ГЕНОМИКА
генетика природе
Дуго читано секвенцирање идентификује експанзије понављања ГГЦ-а у НОТЦХ2НЛЦ повезане са болешћу интрануклеарне инклузије неурона
ОНТ поновно секвенцирање |Иллумина |Целокупно секвенцирање егзома |ЦРИСПР-Цас9 ОНТ циљано секвенцирање |РНА-сек |ОНТ 5мЦ метилација позива
Хигхлигхтс
1. Анализом везе на великој породици НИИД идентификована су два повезана региона.
2. ОНТ секвенцирање засновано на дугом читању и обогаћивање посредовано Цас-9 ОНТ секвенцирање открило је потенцијални генетски узрок експанзије понављања НИИД, ГГЦ у 5′ УТР НОТЦХ2НЛЦ.Ова студија је по први пут пријавила поновљене експанзије гена специфичних за људе који су еволуирали кроз сегментне дупликације.
3. Секвенцирање РНК открило је абнормалне антисенс транскрипте на почетку или унутар региона експанзије понављања ГГЦ у НОТЦХ2НЛЦ.
Позадина
Nеуронал интрануцлеар инцлусион дисеасе (НИИД) је прогресивна и фатална неуродегенеративна болест, коју карактерише присуство еозинофилних хијалинских интрануклеарних инклузија у централном и периферном нервном систему.Његове веома варијабилне клиничке манифестације стварају велике потешкоће у дијагностици до увођења биопсије коже.Међутим, методе засноване на хистопатологији и даље пате од погрешне дијагнозе, што захтева генетско разумевање НИИД-а.
Достигнућа
Линкаге Аналисис
SХорт-реад секвенцирање засновано на секвенцирању целог генома (ВГС) и секвенцирању целог егзома (ВЕС) изведено је на великој породици НИИД (13 погођених и 7 непоражених чланова).Анализа везе на СНП-овима извучена из ових података открила је само два повезана региона: регион од 3,5 Мб на 1п36.31-п36.22 (максимални ЛОД=2,32) и регион од 58,1 Мб на 1п22.1-к21.3 (максимални ЛОД: 4,21 ).Међутим, у овим повезаним регионима нису идентификовани патогени СНП или ЦНВ.
ГГЦ понављање проширења у НОТЦХ2НЛЦ
NСеквенцирање засновано на анопоре је обрађено на 13 погођених и 4 непоражена члана из 8 породица (још један погођени члан је секвенциониран помоћу Пацбио платформе за дуго читање секвенцирања.).Дуго читани подаци открили су експанзије ГГЦ понављања повезаних са болешћу у 5′ УТР мапирања гена НОТЦХ2НЛЦ у 58,1 Мб повезан регион (Слика 1).Ове поновљене експанзије су такође идентификоване у свих 40 спорадичних случајева НИИД-а тестираних РП-ПЦР-ом.
CАс-9 посредовано циљно секвенцирање на платформи нанопора је коришћено да би се постигла већа покривеност читања на понављању НОТЦХ2НЛЦ (100 Кс-1,795 Кс).Ове консензусне секвенце су се добро слагале са претходним налазима о ГГЦ поновљеним експанзијама.Штавише, {(ГГА)н (ГГЦ)н}н понављања су идентификована као потенцијални генетски маркер за фенотип који доминира слабошћу (Слика 2).
Слика 1. Поновљена експанзија повезана са болешћу идентификована на ексону 1 изоформа НОТЦХ2НЛЦ.
Слика 2. Консензус секвенце понављања НПТЦХ2НЛЦ код пацијената са НИИД са (*) или без фенотипа који доминира слабошћу
NОТЦХ2НЛ гени су гени специфични за људе, за које се верује да играју виталну улогу у еволуцији људског мозга и неуролошким болестима.Међутим, три гена повезана са НОТЦХ2 (НОТЦХ2НЛА, НОТЦХ2НЛБ и НОТЦХ2НЛЦ) са >99,1% идентичности секвенце нису решена све до најновијег склопа људског генома.Секвенцирање без синтезе и дуго читање на платформи нанопора показало је значајне предности у решавању региона високе сличности и (ГГЦ)н понављања са 100% богатим ГЦ.
ГГЦ понављање проширења у НОТЦХ2НЛЦ
Tсеквенционирање ранкриптома је обрађено на 2 погођена и 2 непоражена члана.Нормализована дубина читања је израчуната на чулним и антисенс ланцима узводно од првих егзона паралога НОТЦХ2НЛ.Абнормални анти-сенсе транскрипти пронађени су само у погођеним случајевима, који се налазе на почетку или унутар региона поновљене експанзије (љубичасти врхови на Ф1-14 и Ф1-16 на слици 3.).Поред тога, идентификовано је 54 ДЕГ и сви су обогаћени терминима ГО и МПО који се односе на неуронске функције.
Слика 3. Нормализована дубина читања узводно од првог егзона НОТЦХ2НЛЦ у случајевима без утицаја (изнад) и погођеним (испод).
Технологија
Окфорд Нанопоре Тецхнологиес (ОНТ)
Nанопоре секвенцирање се разликује од других платформи секвенцирања по томе што се нуклеотиди читају директно без процеса синтезе ДНК.Како једноланчана ДНК пролази кроз протеинске поре нано величине (нанопоре), различити нуклеотиди стварају различите јонске струје, које се могу ухватити и пренети у секвенцу база.Сама ОНТ платформа за секвенцирање не показује очигледно техничко ограничење дужине очитавања ДНК.Стога су ултра-дуга читања (УЛР) доступна за састављање генома високог квалитета.Штавише, ова изузетно дуга читања, која су довољно дугачка да пређу сложене карактеристике секвенце или структурне варијације, помажу да се овде превазиђу ограничења секвенцирања кратког читања.
Секвенцирање нанопора
Идентификација варијације структуре (СВ).
SСеквенцирање без синтезе је у великој мери сачувало информације о метилацији ДНК на шаблону.Метилирани А, Т, Ц и Г генеришу различите јонске струје од неметилираних, које се могу очитати директно на платформи.Секвенцирање нанопора омогућава профилисање целог генома и 5мЦ и 6мА при резолуцији једног нуклеотида.
Референце
Јун Соне, ет.ал.Дуго читано секвенцирање идентификује експанзије понављања ГГЦ у НОТЦХ2НЛЦ повезане са болешћу интрануклеарне инклузије неурона.Природна генетика (2019)
Тецх анд Хигхлигхтс има за циљ да подели најновију успешну примену различитих технологија секвенцирања високе пропусности у различитим истраживачким аренама, као и бриљантне идеје у експерименталном дизајну и рударењу података.
Време поста: Јан-06-2022