Full-Panjang mRNA Sequencing-Nanopore
Kaunggulan Service
● Low runtuyan bias
● Ngalaan molekul cDNA full-length
● Kurang data anu diperlukeun pikeun nutupan jumlah transkrip anu sarua
● Idéntifikasi sababaraha isoforms per gén
● éksprési quantification dina tingkat isoform
Spésifikasi Service
| Perpustakaan | Platform | Hasil data anu disarankeun (Gb) | Kontrol kualitas |
| cDNA-PCR (Poly-A enriched) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/sampel (Gumantung kana spésiés) | Rasio panjang pinuh> 70% Skor kualitas rata-rata: Q10
|
Analisis bioinformatika
●Ngolah data atah
● idéntifikasi Transcript
● splicing alternatif
● Éksprési quantification dina tingkat gén jeung tingkat isoform
● Analisis éksprési diferensial
● Anotasi fungsi sareng pengayaan (DEG sareng DET)
Syarat Sampel sareng Pangiriman
Syarat Sampel:
Nukléotida:
| Conc.(ng/μl) | Jumlah (μg) | Kasucian | Integritas |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260 / 230 = 0,5-2,5 Kawates atanapi henteu aya kontaminasi protéin atanapi DNA anu dipidangkeun dina gél. | Pikeun tutuwuhan: RIN≥7.0; Pikeun sato: RIN≥7.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; kawates atawa euweuh élévasi dasar |
Tisu: Beurat (garing): ≥1 g
*Pikeun jaringan anu langkung alit ti 5 mg, kami nyarankeun ngirim sampel jaringan flash beku (dina nitrogén cair).
Suspénsi sél: Jumlah sél = 3 × 106- 1 × 107
* Kami nyarankeun pikeun ngirim lysate sél beku.Upami sél éta cacah langkung alit ti 5×105, flash beku dina nitrogén cair disarankeun, nu leuwih hade pikeun ékstraksi mikro.
Sampel getih: Volume≥1 ml
Disarankeun Pangiriman Sampel
Wadahna: 2 ml centrifuge tube (Timah foil teu dianjurkeun)
Sampel panyiri: Grup + ulangan misalna A1, A2, A3;B1, B2, B3...
Kiriman: 2, Garing-és: Sampel kudu dipak dina kantong jeung dikubur dina garing-és.
- Tabung RNAstable: Sampel RNA tiasa dikeringkeun dina tabung stabilisasi RNA (misalna RNAstable®) sareng dikirim dina suhu kamar.
Aliran Gawé Palayanan
Nukléotida:
pangiriman sampel
Pangwangunan perpustakaan
Sequencing
Analisis data
jasa saatos-diobral
Aliran Gawé Palayanan
Tisu:
Desain ékspérimén
pangiriman sampel
ékstraksi RNA
Pangwangunan perpustakaan
Sequencing
Analisis data
jasa saatos-diobral
1.Analisis éksprési diferensial -Volco plot
Analisis éksprési diferensial bisa diolah dina duanana tingkat gén pikeun ngaidentipikasi differentially expressed gén (DEGs) jeung di tingkat isoform pikeun ngaidentipikasi differentially.
Transkrip nyata (DET)
2.Peta panas clustering hirarki
3. Alternatif splicing idéntifikasi jeung klasifikasi
Lima jinis acara splicing alternatif tiasa diprediksi ku Astalavista.
4.Identifikasi kajadian poli-adenilasi (APA) alternatif sareng Motif dina 50 bp hulu poli-A
Kasus BMK
Idéntifikasi splicing alternatif sareng kuantifikasi tingkat isoform ku urutan transkriptom panjang nanopore
Diterbitkeun:Komunikasi Alam, 2020
Strategi urutan:
Golongan: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (mutasi K700E);3. Sél B normal
strategi sequencing: runtuyan perpustakaan Minion 2D, PromethION 1D runtuyan perpustakaan;data pondok-baca tina sampel sarua
Sequencing platform: Nanopore Minion;Nanopore PromethION;
Hasil konci
1.Isoform-tingkat Alternatif Splicing Identification
Runtuyan lila-dibaca empowers idéntifikasi SF3B1 mutantK700E-robah situs splice di tingkat isoform.35 alternatif 3′SSs jeung 10 alternatif 5′SSs kapanggih sacara signifikan diferensial spliced antara SF3B1K700Ejeung SF3B1WT.33 tina 35 alterations anyar kapanggih ku urutan lila dibaca.
2.Isoform-tingkat Alternatif Splicing quantification
Ekspresi isoforms intron ingetan (IR) dina SF3B1K700Ejeung SF3B1WTdiitung dumasar kana sekuen nanopore, ngungkabkeun régulasi global tina isoform IR dina SF3B1K700E.
Rujukan
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Karakterisasi transkrip panjang pinuh ku mutasi SF3B1 dina leukemia limfositik kronis ngungkabkeun turunna régulasi intron anu dipikagaduh [J].Komunikasi Alam.
