Enkelkärnig RNA-sekvensering
Tekniskt system
Isoleringen av kärnorna uppnås med 10× Genomics Chromium™, som består av ett åttakanaligt mikrofluidiksystem med dubbla korsningar. I detta system inkapslas gelkulor med streckkoder och primer, enzymer och en enda kärna i en nanoliterstor oljedroppe, vilket genererar Gel Bead-in-Emulsion (GEM). När GEM har bildats utförs cellys och frisättning av streckkoder i varje GEM. mRNA transkriberas omvänt till cDNA-molekyler med 10× streckkoder och UMI, vilka vidare genomgår standardiserad sekvenseringsbibliotekskonstruktion.
Drag
● Beredning av enkelkärnsuspension från frysta vävnader
● Bildning av Gel Bead-in-Emulsion (GEM) följt av cDNA-syntes
● Varje kula i en GEM är laddad med primers som består av fyra sektioner:
poly(dT)-svans för mRNA-priming och cDNA-syntes,
Unik molekylär identifierare (UMI) för att korrigera amplifieringsbias
10x streckkod
Bindningssekvens för partiell läsning 1-sekvenseringsprimer
Fördelar
Enkelkärns-RNA-sekvensering kringgår begränsningarna med enkelcells-RNA-sekvensering och möjliggör:
● Användning av frysta prover och inte bara begränsat till färska prover
● Låg stress hos frysta celler jämfört med enzymatisk behandling av färska celler, vilket återspeglas i transkriptomdata i form av mindre stressinducerade gener
● Inget behov av föregående avlägsnande av röda blodkroppar
● Obegränsad celldiameter
● Stort utbud av prover som är lämpliga för analys, inklusive komplexa och ömtåliga vävnadstyper som är benägna att cellklumpa ihop sig eller förstöras under vävnadsdissociation
Prover som inte kan analyseras med encellig RNA-sekvensering och är lämpliga för encellig RNA-sekvensering:
| Cell / Vävnad | Resonera |
| Ofräsch fryst vävnad | Det går inte att hämta nya eller länge sparade organisationer |
| Muskelcell, megakaryocyt, fettcell… | Celldiametern är för stor för att komma in i instrumentet |
| Lever… | För ömtålig för att gå sönder, oförmögen att skilja enskilda celler åt |
| Neuroncell, hjärna… | Känsligare, lättare att stressa, kommer att förändra sekvenseringsresultaten |
| Bukspottkörtel, sköldkörtel… | Rik på endogena enzymer, som påverkar produktionen av encellssuspensioner |
Encellig vs. encellig
| Enkelkärnig | Encellig |
| Obegränsad celldiameter | Celldiameter: 10–40 μm |
| Materialet kan vara fryst vävnad | Materialet måste vara färskt vävnadsmaterial |
| Låg stress hos frysta celler | Enzymbehandling kan orsaka cellstressreaktion |
| Inga röda blodkroppar behöver tas bort | Röda blodkroppar behöver tas bort |
| Kärnan uttrycker bioinformation | Hela cellen uttrycker bioinformation |
Specifikationer
| Exempelkrav | Bibliotek | Sekvenseringsstrategi | Rekommenderade data | Kvalitetskontroll |
| Djurvävnad ≥ 200 mg Växtvävnad ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA-bibliotek | Illumina PE150 | 100 000 PE-avläsningar per cell (100–200 Gb) | 700–1200 kärnor/μl och kärnornas integritet observerad under mikroskop |
För mer information om vägledning för provberedning och servicearbetsflöde, vänligen prata med enBMKGENE-expert
Servicearbetsflöde
Inkluderar följande analys:
● Kvalitetskontroll: antal celler, gendetektering, noggrann identifiering av celler, RNA-molekyler och expressionskvantifiering
● Analys av inre prov:
Cellklusterning och klusterannotering
Differentiell uttrycksanalys: identifiering av DEG i kluster
Funktionell annotering och anrikning av kluster-DEG:er
● Analys mellan grupper:
Kombination av data
Differentiell uttrycksanalys: identifiering av DEG i grupper
Funktionell annotering och anrikning av grupp-DEG
● Avancerad analys:
Cellcykelanalys
Pseudotidsanalys
Analys av mobilkommunikation (CellPhoneDB)
Genuppsättningsanrikningsanalys (GSEA)
Inre urvalsanalys
Cellkluster:
Differentiell uttrycksanalys: kluster-DEG:er
Intergruppsanalys
Differentiell uttrycksanalys: Grupp DEG
Avancerad analys:
Pseudotidsanalys:
Cellcykelanalys:
Utforska de framsteg som möjliggjorts av BMKGenes sekvenseringstjänster för enkärnig RNA av 10X Chromium i dessa utvalda publikationer:
Wang, L. et al. (2021) 'Encellig transkriptomisk analys avslöjar immunlandskapet i lungan vid steroidresistent astmaexacerbation',Förhandlingar från National Academy of Sciences i Amerikas förenta stater, 118(2), s. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) 'Ett globalt regleringsnätverk för dysreglerat genuttryck och onormal metabolisk signalering i immunceller i mikromiljön vid Graves sjukdom och Hashimotos tyreoidit',Gränser inom immunologi13, sid. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) 'Encelligt transkriptom avslöjar heterogenitet och immunsvar hos leukocyter efter vaccination med inaktiverad Edwardsiella tarda hos flundra (Paralichthys olivaceus)',Vattenbruk, 566, s. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) 'Fotodynamisk terapi förbättrar resultatet av immunkontrollpunktshämmare genom att ombygga antitumörimmunitet hos patienter med magcancer',Magcancer, 26(5), s. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
