Bidhaa

Mpangilio wa urefu wa mRNA -PacBio

Upangaji wa urefu kamili wa mRNA -Picha Iliyoangaziwa ya PacBio

De novomfuatano wa unukuzi wa urefu kamili, unaojulikana pia kamaDe novoIso-Seq inachukua faida za PacBio sequencer katika urefu wa kusoma, ambayo huwezesha mpangilio wa molekuli za cDNA za urefu kamili bila mapumziko yoyote.Hii huepuka kabisa hitilafu zozote zinazozalishwa katika hatua za mkusanyiko wa nakala na huunda seti za unigene na azimio la kiwango cha isoform.Seti hizi za unigene hutoa taarifa za kinasaba kama "jenomu ya marejeleo" katika kiwango cha transcriptome.Kwa kuongezea, ikichanganya na data ya upangaji wa kizazi kijacho, huduma hii huwezesha ukadiriaji sahihi wa usemi wa kiwango cha isoform.

Jukwaa: PacBio Sequel II

Maktaba: maktaba ya kengele ya SMRT

Wasiliana nasi

Maelezo ya Huduma

Matokeo ya Onyesho

Uchunguzi kifani

Faida za Huduma

● Usomaji wa moja kwa moja wa molekuli ya cDNA ya urefu kamili kutoka 3'- mwisho hadi 5'- mwisho

● Azimio la kiwango cha umbo la iso katika muundo wa mfuatano

● Nakala zilizo na usahihi na uadilifu wa hali ya juu

● Inalingana sana na spishi za vaiours

● Uwezo mkubwa wa kupanga mpangilio wenye mifumo 4 ya ufuataji ya PacBio Sequel II iliyo na vifaa.

● Mwenye uzoefu wa juu na zaidi ya miradi 700 ya mpangilio wa RNA yenye msingi wa Pacbio

● Uwasilishaji wa matokeo kulingana na BMKCloud: Uchimbaji data uliobinafsishwa unapatikana kwenye jukwaa.

● Huduma za baada ya kuuza zitatumika kwa miezi 3 mradi kukamilika

Vipimo vya huduma

Jukwaa: PacBio Sequel II

Maktaba ya mpangilio: Maktaba ya mRNA iliyoboreshwa ya Poly A

Mavuno ya data yanayopendekezwa: Gb 20/sampuli (Kulingana na spishi)

FLNC (%): ≥75%

*FLNC: Nakala za urefu kamili zisizo za chimeric

Uchambuzi wa Bioinformatics

● Uchakataji wa data ghafi

● Utambulisho wa nakala

● Muundo wa mpangilio

● Ukadiriaji wa Usemi

● Dokezo la Utendakazi

Mahitaji ya Sampuli na Uwasilishaji

Mahitaji ya Sampuli:

Nucleotides:

Conc.(ng/μl)

Kiasi (μg)

Usafi

Uadilifu

≥ 120

≥ 0.6

OD260/280=1.7-2.5

OD260/230=0.5-2.5

Uchafuzi wa protini au DNA umepunguzwa au haujaonyeshwa kwenye jeli.

Kwa mimea: RIN≥7.5;

Kwa wanyama: RIN≥8.0;

5.0≥ 28S/18S≥1.0;

mwinuko mdogo au hakuna msingi

Tishu: Uzito (kavu):≥1 g
*Kwa tishu ndogo kuliko miligramu 5, tunapendekeza kutuma sampuli ya tishu iliyogandishwa (katika nitrojeni kioevu).

Kusimamishwa kwa seli:Idadi ya seli = 3 × 10⁶- 1 × 10⁷
*Tunapendekeza kusafirisha lisate ya seli iliyoganda.Ikiwa seli itahesabu ndogo kuliko 5x10⁵, flash iliyogandishwa katika nitrojeni kioevu inapendekezwa, ambayo ni vyema kwa uchimbaji mdogo.

Sampuli za damu:Kiasi≥1 mL

Microorganism:Uzito ≥ 1 g

Uwasilishaji wa Sampuli Uliopendekezwa

Chombo:
2 ml centrifuge tube (bati foil haifai)
Sampuli ya kuweka lebo: Kundi+ kunakili mfano A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Usafirishaji:

1. Barafu kavu: Sampuli zinahitaji kuingizwa kwenye mifuko na kuzikwa kwenye barafu kavu.
2. Mirija ya RNAstable: Sampuli za RNA zinaweza kukaushwa kwenye mirija ya kusawazisha ya RNA (km RNAstable®) na kusafirishwa kwenye joto la kawaida.

Mtiririko wa Kazi ya Huduma

Muundo wa majaribio

Utoaji wa sampuli

Uchimbaji wa RNA

Ujenzi wa maktaba

Kufuatana

Uchambuzi wa data

Huduma za baada ya kuuza

Iliyotangulia: Eukaryotic mRNA Sequencing-Illumina

Inayofuata: Upangaji wa Urefu Kamili wa mRNA-Nanopore

Usambazaji wa urefu wa 1.FLNC

Urefu wa usomaji usio wa chimeric wa urefu kamili(FLNC) unaonyesha urefu wa cDNA katika ujenzi wa maktaba.Usambazaji wa urefu wa FLNC ni kiashirio muhimu katika kutathmini ubora wa ujenzi wa maktaba.

mRNA-FLNC-kusoma-urefu-usambazaji

Usambazaji wa urefu wa kusoma wa FLNC

2.Kamilisha usambazaji wa urefu wa eneo la ORF

Tunatumia TransDecoder kutabiri maeneo ya usimbaji wa protini na mfuatano wa asidi ya amino ili kutengeneza seti za unigene, ambazo zina maelezo kamili ya manukuu yasiyo ya ziada katika sampuli zote.

mRNA-Complete-ORF-urefu-usambazaji

Kamilisha usambazaji wa urefu wa eneo la ORF

3.KEGG uchanganuzi wa uboreshaji wa njia

Nakala zilizoonyeshwa kwa njia tofauti(DETs) zinaweza kutambuliwa kwa kupanga data ya mpangilio wa RNA inayotegemea NGS kwenye seti za manukuu za urefu kamili zinazozalishwa na data ya mpangilio wa PacBio.DET hizi zinaweza kuchakatwa zaidi kwa uchanganuzi mbalimbali wa utendaji, kwa mfano uchanganuzi wa uboreshaji wa njia ya KEGG.

mRNA-DEG-KEGG-njia-utajiri

Uboreshaji wa njia ya DET KEGG -Njama ya nukta

Kesi ya BMK

Mienendo ya maendeleo ya nakala ya shina ya Populus

Iliyochapishwa: Jarida la Bioteknolojia ya mmea, 2019

Mkakati wa mpangilio:
Mkusanyiko wa sampuli:maeneo ya shina: kilele, internodi ya kwanza(IN1), internodi ya pili(IN2), internodi ya tatu(IN3), internodi(IN4) na internode(IN5) kutoka Nanlin895
Mlolongo wa NGS:RNA ya watu 15 waliunganishwa kama sampuli moja ya kibaolojia.Nakala tatu za kibaolojia za kila nukta zilichakatwa kwa mfuatano wa NGS
Mfuatano wa TGS:Mikoa ya shina iligawanywa katika mikoa mitatu, yaani kilele, IN1-IN3 na IN4-IN5.Kila eneo lilichakatwa kwa mpangilio wa PacBio na aina nne za maktaba: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb na 3-10 kb.

Matokeo muhimu

1.Jumla ya nakala 87150 za urefu kamili zilitambuliwa, ambapo, isoforms za riwaya 2081 na isoforms mbadala za riwaya 62058 zilibainishwa.
2.1187 lncRNA na jeni 356 za mchanganyiko zilitambuliwa.
3.Kutoka ukuaji wa msingi hadi ukuaji wa upili, nakala 15838 zilizoonyeshwa kwa njia tofauti kutoka kwa jeni 995 zilizoonyeshwa kwa njia tofauti zilitambuliwa.Katika DEG zote, 1216 zilikuwa sababu za unukuzi, ambazo nyingi bado hazijaripotiwa.
Uchambuzi wa uboreshaji wa 4.GO ulifunua umuhimu wa mgawanyiko wa seli na mchakato wa kupunguza oxidation katika ukuaji wa msingi na upili.