-
การจัดลำดับอาร์เอ็นเอแบบนิวเคลียสเดี่ยว
การพัฒนาเทคนิคการจับเซลล์เดี่ยวและการสร้างไลบรารีแบบกำหนดเอง ควบคู่กับการลำดับดีเอ็นเอความเร็วสูง ได้ปฏิวัติการศึกษาการแสดงออกของยีนในระดับเซลล์ ความก้าวหน้านี้ช่วยให้สามารถวิเคราะห์ประชากรเซลล์ที่ซับซ้อนได้อย่างลึกซึ้งและครอบคลุมมากขึ้น เอาชนะข้อจำกัดที่เกี่ยวข้องกับการหาค่าเฉลี่ยการแสดงออกของยีนในทุกเซลล์ และรักษาความหลากหลายที่แท้จริงภายในประชากรเหล่านี้ไว้ได้ แม้ว่าการลำดับ RNA ระดับเซลล์เดี่ยว (scRNA-seq) จะมีข้อดีที่ปฏิเสธไม่ได้ แต่ก็พบกับความท้าทายในเนื้อเยื่อบางชนิดที่การสร้างสารละลายเซลล์เดี่ยวทำได้ยากและต้องใช้ตัวอย่างสด ที่ BMKGene เราแก้ไขอุปสรรคนี้โดยนำเสนอการลำดับ RNA จากนิวเคลียสเดี่ยว (snRNA-seq) โดยใช้เทคโนโลยี 10X Genomics Chromium ที่ทันสมัย วิธีการนี้ขยายขอบเขตของตัวอย่างที่เหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมในระดับเซลล์เดี่ยว
การแยกนิวเคลียสทำได้โดยใช้ชิป 10X Genomics Chromium ที่ล้ำสมัย ซึ่งมีระบบไมโครฟลูอิดิกส์แปดช่องพร้อมจุดตัดสองจุด ภายในระบบนี้ เม็ดเจลที่ประกอบด้วยบาร์โค้ด ไพรเมอร์ เอนไซม์ และนิวเคลียสเดี่ยวจะถูกห่อหุ้มด้วยหยดน้ำมันขนาดนาโนลิตร ก่อตัวเป็นเจลบีดในอิมัลชัน (Gel Bead-in-Emulsion หรือ GEM) หลังจากการก่อตัวของ GEM เซลล์จะสลายตัวและบาร์โค้ดจะถูกปล่อยออกมาภายใน GEM แต่ละอัน จากนั้นโมเลกุล mRNA จะถูกถอดรหัสย้อนกลับเป็น cDNA ซึ่งประกอบด้วยบาร์โค้ด 10X และตัวระบุโมเลกุลเฉพาะ (Unique Molecular Identifiers หรือ UMI) จากนั้น cDNA เหล่านี้จะถูกนำไปสร้างไลบรารีสำหรับการจัดลำดับตามมาตรฐาน ซึ่งช่วยให้สามารถสำรวจโปรไฟล์การแสดงออกของยีนในระดับเซลล์เดี่ยวได้อย่างครอบคลุมและมีประสิทธิภาพ
แพลตฟอร์ม: 10× Genomics Chromium และแพลตฟอร์ม Illumina NovaSeq
-
การจัดลำดับ mRNA แบบเต็มความยาว - นาโนพอเร
แม้ว่าการจัดลำดับ mRNA ด้วยเทคโนโลยี NGS จะเป็นเครื่องมืออเนกประสงค์สำหรับการวัดปริมาณการแสดงออกของยีน แต่การพึ่งพาข้อมูลการอ่านสั้นๆ ทำให้ประสิทธิภาพในการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมิกส์ที่ซับซ้อนลดลง ในทางกลับกัน การจัดลำดับด้วยนาโนพอเรใช้เทคโนโลยีการอ่านแบบยาว ทำให้สามารถจัดลำดับ mRNA แบบเต็มความยาวได้ วิธีการนี้ช่วยให้สามารถสำรวจการตัดต่อทางเลือก การรวมตัวของยีน การเติมหมู่โพลีอะดีนีน และการวัดปริมาณไอโซฟอร์มของ mRNA ได้อย่างครอบคลุม
การจัดลำดับดีเอ็นเอด้วยนาโนพอเร (Nanopore sequencing) เป็นวิธีการที่อาศัยสัญญาณไฟฟ้าแบบเรียลไทม์ระดับโมเลกุลเดี่ยวของนาโนพอเร ซึ่งให้ผลลัพธ์แบบเรียลไทม์ โดยโปรตีนมอเตอร์จะนำทางให้ดีเอ็นเอสายคู่จับกับโปรตีนนาโนพอเรที่ฝังอยู่ในไบโอฟิล์ม และคลายตัวเมื่อผ่านช่องนาโนพอเรภายใต้ความแตกต่างของแรงดันไฟฟ้า สัญญาณไฟฟ้าที่แตกต่างกันซึ่งเกิดจากเบสต่างๆ บนสายดีเอ็นเอจะถูกตรวจจับและจำแนกแบบเรียลไทม์ ทำให้สามารถจัดลำดับนิวคลีโอไทด์ได้อย่างแม่นยำและต่อเนื่อง แนวทางใหม่นี้เอาชนะข้อจำกัดของการอ่านแบบสั้น และเป็นแพลตฟอร์มแบบไดนามิกสำหรับการวิเคราะห์จีโนมที่ซับซ้อน รวมถึงการศึกษาทรานสคริปโตมิกส์ที่ซับซ้อน ด้วยผลลัพธ์ทันที
แพลตฟอร์ม: Nanopore PromethION 48
-
การจัดลำดับ mRNA แบบเต็มความยาว - PacBio
แม้ว่าการจัดลำดับ mRNA ด้วยเทคโนโลยี NGS จะเป็นเครื่องมืออเนกประสงค์สำหรับการวัดปริมาณการแสดงออกของยีน แต่การพึ่งพาข้อมูลการอ่านสั้นๆ ทำให้การใช้งานในการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมิกส์ที่ซับซ้อนมีข้อจำกัด ในทางกลับกัน การจัดลำดับ PacBio (Iso-Seq) ใช้เทคโนโลยีการอ่านแบบยาว ทำให้สามารถจัดลำดับ mRNA แบบเต็มความยาวได้ วิธีนี้ช่วยให้สามารถสำรวจการตัดต่อทางเลือก การรวมตัวของยีน และการเติมหมู่โพลีอะดีนีนได้อย่างครอบคลุม อย่างไรก็ตาม ยังมีทางเลือกอื่นๆ สำหรับการวัดปริมาณการแสดงออกของยีนเนื่องจากต้องใช้ข้อมูลจำนวนมาก เทคโนโลยีการจัดลำดับ PacBio อาศัยการจัดลำดับแบบเรียลไทม์ระดับโมเลกุลเดี่ยว (SMRT) ซึ่งให้ข้อได้เปรียบที่ชัดเจนในการจับภาพ mRNA แบบเต็มความยาว แนวทางที่เป็นนวัตกรรมนี้เกี่ยวข้องกับการใช้ตัวนำคลื่นแบบศูนย์โหมด (ZMWs) และบ่อขนาดเล็กที่ผลิตด้วยเทคนิคไมโครแฟบริเคชั่น ซึ่งช่วยให้สามารถสังเกตกิจกรรมของเอนไซม์ DNA polymerase แบบเรียลไทม์ในระหว่างการจัดลำดับได้ ภายใน ZMW เหล่านี้ เอนไซม์ DNA polymerase ของ PacBio จะสังเคราะห์สาย DNA ที่เสริมกัน ทำให้เกิดลำดับการอ่านยาวที่ครอบคลุมทั้งทรานสคริปต์ mRNA การทำงานของ PacBio ในโหมด Circular Consensus sequencing (CCS) ช่วยเพิ่มความแม่นยำโดยการจัดลำดับโมเลกุลเดียวกันซ้ำๆ ลำดับการอ่าน HiFi ที่สร้างขึ้นมีความแม่นยำเทียบเท่ากับ NGS ซึ่งช่วยสนับสนุนการวิเคราะห์คุณลักษณะทางทรานสคริปโตมิกที่ซับซ้อนได้อย่างครอบคลุมและน่าเชื่อถือยิ่งขึ้น
แพลตฟอร์ม: PacBio ภาคต่อ II; PacBio รีวิโอ
-
การจัดลำดับ mRNA ของยูคาริโอต (NGS)
การจัดลำดับ mRNA เป็นเทคนิคที่ใช้เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นใหม่เพื่อเปิดเผยการมีอยู่และปริมาณของโมเลกุล RNA ในตัวอย่างทางชีวภาพ ซึ่งให้ภาพรวมของการแสดงออกของยีนในตัวอย่างนั้น
ด้วยการใช้งานที่หลากหลาย เครื่องมือล้ำสมัยนี้ช่วยเปิดเผยข้อมูลการแสดงออกของยีน โครงสร้างยีน และกลไกระดับโมเลกุลที่ซับซ้อน ซึ่งเกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีววิทยาที่หลากหลาย
เทคนิคนี้ได้รับการนำมาใช้อย่างกว้างขวางในการวิจัย การวินิจฉัยทางคลินิก และการพัฒนายา เนื่องจากให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับความซับซ้อนของพลวัตของเซลล์และการควบคุมทางพันธุกรรม ซึ่งเป็นพื้นฐานที่มั่นคงในการจุดประกายความอยากรู้เกี่ยวกับศักยภาพของเทคนิคนี้ในสาขาต่างๆ
แพลตฟอร์มที่ใช้งานได้: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
-
การจัดลำดับ mRNA โดยไม่อ้างอิง (Non-Reference based mRNA Sequencing-NGS)
การถอดรหัสลำดับ mRNA ช่วยให้สามารถวิเคราะห์รายละเอียดของ mRNA ทั้งหมดภายในเซลล์ภายใต้สภาวะที่กำหนดได้อย่างครอบคลุม เทคโนโลยีล้ำสมัยนี้เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการเปิดเผยข้อมูลการแสดงออกของยีน โครงสร้างยีน และกลไกโมเลกุลที่ซับซ้อนซึ่งเกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีววิทยาที่หลากหลาย การถอดรหัสลำดับ mRNA ได้รับการนำไปใช้อย่างกว้างขวางในการวิจัยพื้นฐาน การวินิจฉัยทางคลินิก และการพัฒนายา โดยให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับความซับซ้อนของพลวัตของเซลล์และการควบคุมทางพันธุกรรม
แพลตฟอร์ม: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
-
การจัดลำดับดีเอ็นเอแบบยาวที่ไม่เข้ารหัส - อิลลูมินา
RNA ที่ไม่เข้ารหัสแบบยาว (lncRNA) มีความยาวมากกว่า 200 นิวคลีโอไทด์ มีศักยภาพในการเข้ารหัสต่ำมาก และเป็นองค์ประกอบสำคัญในกลุ่ม RNA ที่ไม่เข้ารหัส พบได้ในนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม RNA เหล่านี้มีบทบาทสำคัญในการควบคุมทางด้านเอพิเจเนติกส์ การถอดรหัส และการควบคุมหลังการถอดรหัส ซึ่งเน้นย้ำถึงความสำคัญของพวกมันในการกำหนดกระบวนการระดับเซลล์และโมเลกุล การจัดลำดับ lncRNA เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการศึกษาการจำแนกเซลล์ การเจริญเติบโตของสิ่งมีชีวิต และโรคต่างๆ ในมนุษย์
แพลตฟอร์ม: Illumina NovaSeq X
-
การจัดลำดับ RNA ขนาดเล็ก - อิลลูมินา
RNA ขนาดเล็กเป็นกลุ่มของโมเลกุล RNA ที่รวมถึงไมโคร RNA (miRNA), RNA รบกวนขนาดเล็ก (siRNA) และ RNA ที่มีปฏิสัมพันธ์กับ piwi (piRNA) ในบรรดาโมเลกุลเหล่านี้ miRNA ซึ่งมีความยาวประมาณ 18-25 นิวคลีโอไทด์ มีความสำคัญเป็นพิเศษเนื่องจากมีบทบาทสำคัญในการควบคุมกระบวนการต่างๆ ในเซลล์ miRNA มีรูปแบบการแสดงออกที่จำเพาะต่อเนื้อเยื่อและระยะต่างๆ และมีการอนุรักษ์สูงในสิ่งมีชีวิตต่างชนิดกัน
แพลตฟอร์ม: Illumina NovaSeq
-
การจัดลำดับ CircRNA - Illumina
การจัดลำดับ RNA วงกลม (circRNA-seq) เป็นการสร้างโปรไฟล์และวิเคราะห์ RNA วงกลม ซึ่งเป็นโมเลกุล RNA ประเภทหนึ่งที่เกิดเป็นวงปิดเนื่องจากกระบวนการสไปลซิงที่ไม่เป็นไปตามแบบแผน ทำให้ RNA ชนิดนี้มีเสถียรภาพมากขึ้น แม้ว่า circRNA บางชนิดจะทำหน้าที่เป็นเหมือนฟองน้ำดักจับ microRNA โดยกักเก็บ microRNA ไว้และป้องกันไม่ให้ microRNA ควบคุม mRNA เป้าหมาย แต่ circRNA อื่นๆ อาจมีปฏิสัมพันธ์กับโปรตีน ปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยีน หรือมีบทบาทในกระบวนการต่างๆ ของเซลล์ การวิเคราะห์การแสดงออกของ circRNA ช่วยให้เข้าใจบทบาทการควบคุมของโมเลกุลเหล่านี้และความสำคัญของพวกมันในกระบวนการต่างๆ ของเซลล์ ระยะการพัฒนา และสภาวะของโรค ซึ่งนำไปสู่ความเข้าใจที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับความซับซ้อนของการควบคุม RNA ในบริบทของการแสดงออกของยีน
แพลตฟอร์ม: Illumina Novaseq X
-
การวิเคราะห์ลำดับจีโนมทั้งหมด – อิลลูมินา
การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดของจีโนม (Wole transcriptome sequencing) นำเสนอแนวทางที่ครอบคลุมในการวิเคราะห์โมเลกุล RNA ที่หลากหลาย ซึ่งรวมถึง RNA ที่เข้ารหัส (mRNA) และ RNA ที่ไม่เข้ารหัส (lncRNA, circRNA และ miRNA) เทคนิคนี้สามารถบันทึกจีโนมทั้งหมดของเซลล์เฉพาะในช่วงเวลาใดเวลาหนึ่ง ทำให้เข้าใจกระบวนการภายในเซลล์ได้อย่างครบถ้วน
แพลตฟอร์มที่ใช้งานได้: Illumina Novaseq X
