การจัดลำดับอาร์เอ็นเอแบบนิวเคลียสเดี่ยว
แผนทางเทคนิค
การแยกนิวเคลียสทำได้โดยใช้ 10× Genomics Chromium™ ซึ่งประกอบด้วยระบบไมโครฟลูอิดิกส์แปดช่องที่มีจุดตัดสองจุด ในระบบนี้ เม็ดเจลที่มีบาร์โค้ดและไพรเมอร์ เอนไซม์ และนิวเคลียสเดี่ยวจะถูกห่อหุ้มไว้ในหยดน้ำมันขนาดนาโนลิตร ทำให้เกิดเจลบีดในอิมัลชัน (Gel Bead-in-Emulsion หรือ GEM) เมื่อ GEM เกิดขึ้นแล้ว จะทำการสลายเซลล์และปล่อยบาร์โค้ดภายใน GEM แต่ละอัน mRNA จะถูกถอดรหัสย้อนกลับเป็นโมเลกุล cDNA ที่มีบาร์โค้ด 10× และ UMI ซึ่งจะถูกนำไปสร้างไลบรารีสำหรับการจัดลำดับตามมาตรฐานต่อไป
คุณสมบัติ
● การเตรียมสารแขวนลอยนิวเคลียสเดี่ยวจากเนื้อเยื่อแช่แข็ง
● การก่อตัวของเจลบีดในอิมัลชัน (GEM) ตามด้วยการสังเคราะห์ cDNA
● ลูกปัดแต่ละเม็ดใน GEM บรรจุไพรเมอร์ซึ่งประกอบด้วย 4 ส่วน:
หางโพลี(dT) สำหรับการเริ่มต้น mRNA และการสังเคราะห์ cDNA
ตัวระบุโมเลกุลเฉพาะ (UMI) เพื่อแก้ไขความลำเอียงในการขยายสัญญาณ
บาร์โค้ด 10x
ลำดับการจับของไพรเมอร์ลำดับการอ่านบางส่วน 1
ข้อดี
การถอดรหัสลำดับ RNA จากนิวเคลียสเดี่ยวช่วยแก้ไขข้อจำกัดของการถอดรหัสลำดับ RNA จากเซลล์เดี่ยว ทำให้สามารถทำสิ่งต่อไปนี้ได้:
● การใช้ตัวอย่างแช่แข็ง ไม่จำกัดเฉพาะตัวอย่างสดเท่านั้น
● เซลล์แช่แข็งมีความเครียดต่ำกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการบำบัดด้วยเอนไซม์ของเซลล์สด ซึ่งสะท้อนให้เห็นในข้อมูลทรานสคริปโตมในรูปแบบของยีนที่ถูกกระตุ้นจากความเครียดน้อยลง
● ไม่จำเป็นต้องกำจัดเม็ดเลือดแดงออกก่อน
● เส้นผ่านศูนย์กลางเซลล์ไม่จำกัด
● มีตัวอย่างหลากหลายประเภทที่สามารถนำมาวิเคราะห์ได้ รวมถึงเนื้อเยื่อที่ซับซ้อนและเปราะบาง ซึ่งมีแนวโน้มที่จะเกิดการจับตัวเป็นก้อนของเซลล์หรือถูกทำลายระหว่างการแยกเนื้อเยื่อ
ตัวอย่างที่ไม่สามารถวิเคราะห์ได้ด้วยการจัดลำดับ RNA ระดับเซลล์เดี่ยว และเหมาะสมสำหรับการจัดลำดับ RNA ระดับนิวเคลียสเดี่ยว:
| เซลล์/เนื้อเยื่อ | เหตุผล |
| เนื้อเยื่อแช่แข็งที่ไม่สดใหม่ | ไม่สามารถค้นหาองค์กรที่ใหม่หรือที่บันทึกไว้นานได้ |
| เซลล์กล้ามเนื้อ, เมกะคาริโอไซต์, ไขมัน… | ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของเซลล์ใหญ่เกินไปที่จะเข้าไปในเครื่องมือได้ |
| ตับ… | เปราะบางเกินกว่าจะแตกหักได้ ไม่สามารถแยกแยะเซลล์แต่ละเซลล์ได้ |
| เซลล์ประสาท, สมอง… | มีความไวต่อสิ่งเร้ามากขึ้น เครียดง่าย และจะส่งผลต่อผลลัพธ์ของการจัดลำดับดีเอ็นเอ |
| ตับอ่อน, ต่อมไทรอยด์… | อุดมไปด้วยเอนไซม์ภายในเซลล์ ซึ่งส่งผลต่อการผลิตสารละลายเซลล์เดี่ยว |
นิวเคลียสเดี่ยวเทียบกับเซลล์เดี่ยว
| นิวเคลียสเดี่ยว | เซลล์เดี่ยว |
| เส้นผ่านศูนย์กลางเซลล์ไม่จำกัด | เส้นผ่านศูนย์กลางเซลล์: 10-40 ไมโครเมตร |
| วัสดุดังกล่าวอาจเป็นเนื้อเยื่อแช่แข็ง | วัสดุที่ใช้ต้องเป็นเนื้อเยื่อสด |
| ความเครียดต่ำของเซลล์แช่แข็ง | การบำบัดด้วยเอนไซม์อาจทำให้เกิดปฏิกิริยาความเครียดในเซลล์ |
| ไม่จำเป็นต้องนำเม็ดเลือดแดงออก | จำเป็นต้องกำจัดเม็ดเลือดแดงออกไป |
| นิวเคลียร์แสดงข้อมูลชีวภาพ | เซลล์ทั้งเซลล์แสดงออกถึงข้อมูลทางชีวภาพ |
ข้อกำหนด
| ตัวอย่างข้อกำหนด | ห้องสมุด | กลยุทธ์การจัดลำดับ | ข้อมูลที่แนะนำ | การควบคุมคุณภาพ |
| เนื้อเยื่อสัตว์ ≥ 200 มก. เนื้อเยื่อพืช ≥ 400 มก. | ไลบรารี cDNA ของ 10x Genomics sn | อิลลูมินา พีอี150 | เซลล์หนึ่งอ่านค่า PE ได้ 100,000 ครั้ง (100-200 กิกะไบต์) | มีนิวเคลียส 700-1200 นิวเคลียสต่อไมโครลิตร และสังเกตความสมบูรณ์ของนิวเคลียสภายใต้กล้องจุลทรรศน์ |
หากต้องการรายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับคำแนะนำในการเตรียมตัวอย่างและขั้นตอนการให้บริการ โปรดติดต่อสอบถามได้เลยผู้เชี่ยวชาญ BMKGENE
ขั้นตอนการให้บริการ
ประกอบด้วยการวิเคราะห์ดังต่อไปนี้:
● การควบคุมคุณภาพ: จำนวนเซลล์ การตรวจจับยีน การระบุเซลล์อย่างแม่นยำ โมเลกุล RNA และการหาปริมาณการแสดงออกของยีน
● การวิเคราะห์ตัวอย่างภายใน:
การจัดกลุ่มเซลล์และการระบุกลุ่มเซลล์
การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกัน: การระบุกลุ่มยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (DEGs)
การระบุหน้าที่และการเพิ่มจำนวนของกลุ่มยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (DEGs)
● การวิเคราะห์เปรียบเทียบระหว่างกลุ่ม:
การรวมข้อมูล
การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกัน: การระบุยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกันในแต่ละกลุ่ม
การระบุหน้าที่และการเพิ่มจำนวนกลุ่มยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (DEGs)
● การวิเคราะห์ขั้นสูง:
การวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์
การวิเคราะห์เวลาเสมือน
การวิเคราะห์การสื่อสารผ่านโทรศัพท์มือถือ (CellPhoneDB)
การวิเคราะห์การเสริมคุณค่าชุดยีน (GSEA)
การวิเคราะห์ตัวอย่างภายใน
การรวมกลุ่มของเซลล์:
การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกัน: จัดกลุ่มยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (DEGs)
การวิเคราะห์ระหว่างกลุ่ม
การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกัน: กลุ่มยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (DEGs)
การวิเคราะห์ขั้นสูง:
การวิเคราะห์เวลาเสมือน:
การวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์:
สำรวจความก้าวหน้าต่างๆ ที่เกิดขึ้นจากบริการการจัดลำดับ RNA จากนิวเคลียสเดี่ยวของ BMKGene โดยใช้ 10X Chromium ในเอกสารเผยแพร่เด่นเหล่านี้:
Wang, L. และคณะ (2021) 'การวิเคราะห์ทรานสคริปโตมิกส์ระดับเซลล์เดี่ยวเผยให้เห็นภูมิทัศน์ภูมิคุ้มกันของปอดในภาวะหอบหืดกำเริบที่ไม่ตอบสนองต่อสเตียรอยด์'วารสารของสถาบันวิทยาศาสตร์แห่งชาติแห่งสหรัฐอเมริกา, 118(2), หน้า e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. และคณะ (2022) 'เครือข่ายควบคุมระดับโลกสำหรับการแสดงออกของยีนที่ผิดปกติและการส่งสัญญาณเมตาบอลิซึมที่ผิดปกติในเซลล์ภูมิคุ้มกันในสภาพแวดล้อมจุลภาคของโรคเกรฟส์และโรคต่อมไทรอยด์อักเสบฮาชิโมโตะ'แนวหน้าในภูมิคุ้มกันวิทยา, 13, น. 879824. ดอย: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. และคณะ (2023) 'การถอดรหัสพันธุกรรมระดับเซลล์เดี่ยวเผยให้เห็นความหลากหลายและการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเม็ดเลือดขาวหลังการฉีดวัคซีนด้วยเชื้อ Edwardsiella tarda ที่ไม่ทำงานแล้วในปลาลิ้นหมา (Paralichthys olivaceus)'การเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ, 566, หน้า 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. และคณะ (2023) 'การบำบัดด้วยแสงช่วยปรับปรุงผลลัพธ์ของการใช้สารยับยั้งจุดตรวจสอบภูมิคุ้มกันโดยการปรับเปลี่ยนภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอกในผู้ป่วยมะเร็งกระเพาะอาหาร'มะเร็งกระเพาะอาหาร, 26(5), หน้า 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
