TRANSCRIPTOMICS
kalikasan
KOMUNIKASYON
Ang buong-haba na transcript characterization ng SF3B1 mutation sa talamak na lymphocytic leukemia ay nagpapakita ng downregulation ng mga napanatili na introns
Mga full-length na transcript|Nanopore sequencing|Alternatibong pagsusuri ng isoform
Background
SAng mga omatic mutations sa splicing factor na SF3B1 ay malawakang naiulat na nauugnay sa iba't ibang mga kanser, kabilang ang talamak na lymphocytic leukemia(CLL), uveal melanoma, kanser sa suso, atbp. Bilang karagdagan, ang mga maikling nabasang transcriptomic na pag-aaral ay nagsiwalat ng mga aberrant na pattern ng splicing na dulot ng SF3B1 mutations.Gayunpaman, ang mga pag-aaral sa mga alternatibong pattern ng splicing na ito ay matagal nang limitado sa antas ng kaganapan at kakulangan ng kaalaman sa antas ng isoform dahil sa limitasyon ng mga short-read na pinagsama-samang transcript.Dito, ipinakilala ang nanopore sequencing platform upang makabuo ng mga full-length na transcript, na nagbigay ng kapangyarihan sa pagsisiyasat sa AS isoforms.
Eksperimental na Disenyo
Mga eksperimento
Pagpapangkat:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E mutation);3. Mga normal na B-cell
Diskarte sa pagkakasunud-sunod:MiniON 2D library sequencing, PromethION 1D library sequencing;maikling-read na data mula sa parehong mga sample
Sequencing platform:ONT Minion;ONT PromethION;
Pagsusuri ng Bioinformatic
Mga resulta
Akabuuang 257 milyong pagbabasa ay nabuo mula sa 6 na mga sample ng CLL at 3 B-cell.Sa average ng 30.5% ng mga nabasang ito ay natukoy bilang mga full-length na transcript.
FAng ull-length na alternatibong isoform analysis ng RNA(FLAIR) ay binuo upang makabuo ng isang set ng mga isoform na may mataas na kumpiyansa.Ang FLAIR ay maaaring i-summarize bilang:
Nanopore reads alignment: tukuyin ang pangkalahatang transcript structure batay sa reference genome;
Spagwawasto ng plice junction: iwasto ang mga error sa sequence(pula) na may splice site mula sa alinman sa mga annotated intron, intron mula sa short-read na data o pareho;
Collapse: ibuod ang mga kinatawan na isoform batay sa mga splice junction chain (first-pass set).Pumili ng mataas na kumpiyansa mula sa batay sa bilang ng mga sumusuportang pagbabasa(Threshold: 3).
Figure 1. FLAIR analysis para matukoy ang full-lenth isoform na nauugnay sa SF3B1 mutation sa CLL
FNatukoy ng LAIR ang 326,699 high-confidence spliced isoform, 90% nito ay mga novel isoform.Karamihan sa mga hindi na-notate na isoform na ito ay natagpuang mga nobelang kumbinasyon ng mga kilalang splice juntions(142,971), habang ang iba pang nobelang isoform ay naglalaman ng alinman sa napanatili na intron(21,700) o novel exon(3594).
LAng mga ong-read na sequence ay nagbibigay ng kapangyarihan sa pagkakakilanlan ng mutant SF3B1-K700E -binagong mga site ng splice sa antas ng isoform.35 alternatibong 3'SSs at 10 alternatibong 5'SSs ay natagpuan na may makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng SF3B1-K700E at SF3B1-WT.33 sa 35 na pagbabago ay bagong natuklasan ng matagal nang nabasa na mga pagkakasunud-sunod.Sa data ng Nanopore, ang distribusyon ng distansya sa pagitan ng SF3B1-K700E-altered 3'SSs sa mga canonical na site na mga peak ay nasa paligid -20 bp, na malaki ang pagkakaiba sa isang control distribution, katulad ng naiulat sa CLL short-read sequence.Ang mga isoform ng ERGIC3 gene ay nasuri, kung saan ang isang nobelang isoform na naglalaman ng proximal splice site ay natagpuang mas sagana sa SF3B1-K700E .Ang parehong proximal at distal na 3'SS ay nauugnay sa mga natatanging pattern ng AS na bumubuo ng maraming isoform.
Figure 2. Alternatibong 3′ splicing pattern na kinilala sa data ng pagkakasunud-sunod ng nanopore
Matagal nang limitado ang pagsusuri sa paggamit ng kaganapan ng IR sa pagsusuring batay sa maikling pagbasa dahil sa kumpiyansa sa pagkakakilanlan at dami ng IR.Ang pagpapahayag ng mga isoform ng IR sa SF3B1-K700E at SF3B1-WT ay na-quantified batay sa mga pagkakasunud-sunod ng nanopore, na nagpapakita ng isang pandaigdigang down-regulation ng mga isoform ng IR sa SF3B1-K700E.
Figure 4. Sidhi ng agrikultura at pagkakakonekta ng network sa tatlong sistema ng pagsasaka (A at B);Random forest analysis(C) at Relasyon sa pagitan ng agricultural intensity at AMF colonization (D)
Figure 3. Ang mga kaganapan sa pag-renta ng intron ay mas mahigpit na binabawasan ang regulasyon sa CLL SF3B1-K700E
Teknolohiya
Nanopore Long-read Sequencing
NAng anopore sequencing ay isang molekula na real-time na teknolohiya sa pagkakasunud-sunod ng signal ng kuryente.
DAng ouble-stranded na DNA o RNA ay magbubuklod sa nanoporous na protina na naka-embed sa biofilm at mag-unwinding sa ilalim ng lead ng motor protein.
DAng mga strand ng NA/RNA ay dumadaan sa nanopore channel protein sa isang tiyak na bilis sa ilalim ng pagkilos ng pagkakaiba ng boltahe.
Mang mga olecule ay bumubuo ng iba't ibang mga signal ng kuryente ayon sa istruktura ng kemikal.
RAng eal-time na pagtuklas ng mga sequence ay nakakamit sa pamamagitan ng base calling.
Pagganap ng full-length transcriptome sequencing
√ Saturation ng Data
7-fold na mas kaunting mga pagbabasa na kinakailangan upang maabot ang maihahambing na saturation ng data.
√ Transcript Structure Identification
Pagkilala sa magkakaibang mga variant ng istruktura na may consensus full-length na pagbabasa ng bawat transcript
√ Transcript-level differential analysis -Ipakita ang mga pagbabagong itinago ng mga maikling-read
Sanggunian
Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Ang buong-haba na transcript characterization ng SF3B1 mutation sa talamak na lymphocytic leukemia ay nagpapakita ng downregulation ng mga napanatili na intron [J].Komunikasyon sa Kalikasan.
Tech at Highlight naglalayong ibahagi ang pinakahuling matagumpay na aplikasyon ng iba't ibang high-throughput na teknolohiya sa pagkakasunud-sunod sa iba't ibang arena ng pananaliksik pati na rin ang mga mahuhusay na ideya sa eksperimental na disenyo at data mining .
Oras ng post: Ene-08-2022