Повнорозмірне секвенування мРНК -PacBio
Переваги сервісу
● Пряме зчитування повної довжини молекули кДНК від 3'- кінця до 5'- кінця
● Роздільна здатність рівня ізоформи в структурі послідовності
● Стенограми з високою точністю та цілісністю
● Висока сумісність з різними видами
● Велика ємність секвенування з 4 обладнаними платформами секвенування PacBio Sequel II
● Великий досвід у більш ніж 700 проектах секвенування РНК на основі Pacbio
● Доставка результатів на основі BMKCloud: індивідуальний аналіз даних доступний на платформі.
● Післяпродажне обслуговування дійсне протягом 3 місяців після завершення проекту
Специфікації послуги
Платформа: PacBio Sequel II
Бібліотека секвенування: бібліотека мРНК, збагачена Poly A
Рекомендований вихід даних: 20 Гб/зразок (залежно від виду)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: повнометражні нехимерні транскрипти
Біоінформаційні аналізи
● Обробка необроблених даних
● Ідентифікація стенограми
● Структура послідовності
● Кількісна оцінка експресії
● Анотація функції
Вимоги до зразків і доставка
Вимоги до зразків:
Нуклеотиди:
| Конц. (нг/мкл) | Кількість (мкг) | Чистота | Цілісність |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 На гелі виявлено обмежене забруднення білком або ДНК або його відсутність. | Для рослин: RIN≥7,5; Для тварин: RIN≥8,0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; обмежене підвищення або відсутність базової лінії |
Тканина: Вага (суха):≥1 г
*Для тканини менше 5 мг ми рекомендуємо надсилати швидкозаморожений (у рідкому азоті) зразок тканини.
Суспензія клітин:Кількість клітин = 3×106- 1×107
*Ми рекомендуємо відправляти заморожений лізат клітин.У випадку, якщо число клітинок менше 5×105, рекомендується швидке заморожування в рідкому азоті, що є кращим для мікроекстракції.
Зразки крові:Об'єм≥1 мл
мікроорганізм:Маса ≥ 1 г
Рекомендована доставка зразків
Контейнер:
Центрифужна пробірка на 2 мл (фольга не рекомендована)
Зразок маркування: Група + копія, наприклад, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Відвантаження:
1. Сухий лід: Зразки потрібно упакувати в мішки та закопати в сухий лід.
2. Пробірки для стабілізації РНК: зразки РНК можна висушити в пробірці для стабілізації РНК (наприклад, RNAstable®) і відправити при кімнатній температурі.
Потік роботи служби
Дизайн експерименту
Доставка зразків
екстракція РНК
Будівництво бібліотеки
Секвенування
Аналіз даних
Післяпродажне обслуговування
1. Розподіл довжини FLNC
Довжина повнорозмірного нехимерного зчитування (FLNC) вказує на довжину кДНК у конструкції бібліотеки.Розподіл довжини FLNC є вирішальним показником в оцінці якості побудови бібліотеки.
Розподіл довжини читання FLNC
2. Повний розподіл довжини області ORF
Ми використовуємо TransDecoder для прогнозування ділянок кодування білка та відповідних амінокислотних послідовностей для генерації наборів унігенів, які містять повну ненадлишкову інформацію про транскрипт у всіх зразках.
Повний розподіл довжини області ORF
3. Аналіз збагачення шляху KEGG
Диференційно експресовані транскрипти (DET) можна ідентифікувати шляхом вирівнювання даних секвенування РНК на основі NGS із наборами повнорозмірних транскриптів, створених за допомогою даних секвенування PacBio.Ці DET можна додатково обробляти для різноманітного функціонального аналізу, наприклад аналізу збагачення шляху KEGG.
Збагачення шляху DET KEGG - Точкова діаграма
Корпус БМК
Динаміка розвитку транскриптома стебла Populus
Опубліковано: Журнал біотехнології рослин, 2019 рік
Стратегія послідовності:
Колекція зразків:ділянки стебла: верхівка, перше міжвузля (IN1), друге міжвузля (IN2), третє міжвузля (IN3), міжвузля (IN4) і міжвузля (IN5) від Nanlin895
NGS-послідовність:РНК 15 осіб були об'єднані в один біологічний зразок.Три біологічні репліки кожної точки були оброблені для послідовності NGS
TGS-послідовність:Стовбурові області були розділені на три області, тобто апекс, IN1-IN3 і IN4-IN5.Кожну область обробляли для секвенування PacBio за допомогою чотирьох типів бібліотек: 0-1 кб, 1-2 кб, 2-3 кб і 3-10 кб.
Ключові результати
1. Було ідентифіковано 87150 повнорозмірних транскриптів, у яких ідентифіковано 2081 нову ізоформу та 62058 нових альтернативних сплайсованих ізоформ.
Було ідентифіковано 2,1187 lncRNA і 356 злитих генів.
3. Від первинного росту до вторинного росту було ідентифіковано 15838 диференційно експресованих транскриптів з 995 диференційовано експресованих генів.У всіх DEG 1216 були факторами транскрипції, про більшість з яких ще не повідомлялося.
Аналіз збагачення 4.GO виявив важливість поділу клітин і процесів окиснення-відновлення в первинному та вторинному зростанні.
Альтернативні події сплайсингу та різні ізоформи
Аналіз WGCNA на фактори транскрипції
довідка
Chao Q, Gao ZF, Zhang D та ін.Динаміка розвитку транскриптома стебла Populus.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
