میٹاجینومکس
نینو پور کی ترتیب کا استعمال کرتے ہوئے مائکرو بایوم سے مکمل، بند بیکٹیریل جینوم
نانوپور کی ترتیب |میٹاجینومکس |MAGs |بیکٹیریل جینوم سرکلرائزیشن |گٹ مائکرو بائیوٹا
جھلکیاں
اس تحقیق میں ڈی این اے کے لمبے ٹکڑوں کو نکالنے کا ایک نیا طریقہ پیش کیا گیا، جس نے 300 ملی گرام پاخانہ سے طویل پڑھنے کے لیے موزوں خالص، HMW DNA کے مائیکروگرام کو نکالا
2۔اس مطالعہ میں ایک اسمبلی ورک فلو، لیتھ، متعارف کرایا گیا، جہاں MAGs کو لمبی پڑھائی کے ذریعے جمع کیا گیا اور مختصر پڑھنے کے ذریعے درست کیا گیا۔
3. لیتھ کا اندازہ فرضی مکسچر سے کیا گیا تھا۔12 میں سے 7 بیکٹیریا کو کامیابی کے ساتھ سنگل کانٹیگز میں اور 3 کو چار یا اس سے کم کانٹیگز میں جمع کیا گیا۔
4. لیتھ کو پاخانے کے نمونوں پر مزید لاگو کیا گیا، جس نے 20 سرکلرائزڈ جینوم تیار کیے، جن میں پریوٹیلا کوپری اور امیدوار Cibiobacter sp شامل ہیں۔، جو موبائل جینیاتی عناصر سے مالا مال ہونے کے لئے جانا جاتا تھا۔
اہم کامیابی
HWM DNA کے لیے نکالنے کا پروٹوکول
طویل پڑھی جانے والی ترتیب پر مبنی گٹ میٹاجینومک اسٹڈیز کو طویل عرصے سے پاخانے سے ہائی مالیکیولر ویٹ (HMW) DNA نکالنے میں سختی کا سامنا ہے۔اس مطالعہ میں، روایتی طریقوں میں مالا کی پٹائی کے ذریعے بڑے پیمانے پر مونڈنے سے بچنے کے لیے ایک انزائم پر مبنی نکالنے کا پروٹوکول متعارف کرایا گیا تھا۔جیسا کہ مندرجہ ذیل تصویر میں دکھایا گیا ہے، نمونوں کا علاج سب سے پہلے انزائمز کے کاک ٹیل سے کیا گیا تھا، بشمول لائٹک انزائم، میٹا پولیزیم، وغیرہ۔جاری کردہ ڈی این اے کو فینول-کلوروفارم سسٹم کے ذریعے نکالا گیا، اس کے بعد پروٹیناز K اور RNase A ہاضمہ، کالم پر مبنی پیوریفیکیشن اور SPRI سائز کا انتخاب۔یہ طریقہ 300 میٹر سٹول سے HMW DNA کے مائیکرو گرام حاصل کرنے میں کامیاب ہوا، جو معیار اور مقدار دونوں کے لحاظ سے طویل پڑھے جانے والے تسلسل کی ضروریات کو پورا کرتا ہے۔
شکل 1. HWM DNA نکالنے کی اسکیم
لیتھ کی اسکیم کا بہاؤ
جیسا کہ درج ذیل تصویر میں بیان کیا گیا ہے، لیتھ میں گپی کا استعمال کرتے ہوئے خام بیس کالنگ کے موجودہ عمل پر مشتمل ہے۔اس کے بعد دو طویل پڑھی جانے والی اسمبلیاں فلائی اور کینو الگ الگ تیار کرتی ہیں جس کے بعد غلط اسمبلی کا پتہ لگانا اور ہٹانا ہوتا ہے۔دونوں ذیلی اسمبلیوں کو فوری مرج کے ساتھ ضم کر دیا گیا ہے۔ضم ہونے پر، میگا بیس کی سطح پر بڑی اسمبلیوں کو پھر سرکلرائزیشن کے لیے چیک کیا جاتا ہے۔اس کے بعد، ان اسمبلیوں پر اتفاق رائے کو مختصر پڑھنے کے ساتھ عمل میں لایا جاتا ہے۔حتمی طور پر جمع ہونے والے بیکٹیریل جینومز کو حتمی غلط اسمبلی کا پتہ لگانے اور ہٹانے کے لیے پروسیس کیا جاتا ہے۔
شکل 2. لیتھ اسمبلی کی اسکیم کا بہاؤ
فرضی بیکٹیریا کے مرکب کے ساتھ لیتھ کا اندازہ
ایم اے جی اسمبلی میں نینو پور سیکوینسنگ پلیٹ فارم اور لیتھ کی کارکردگی کا جائزہ لینے کے لیے ایک معیاری اے ٹی سی سی 12 پرجاتیوں کا مرکب جس میں گرام مثبت اور گرام منفی دونوں بیکٹیریا شامل تھے۔5.9 kb کے N50 کے ساتھ کل 30.3 Gb ڈیٹا نینو پور پلیٹ فارم سے تیار کیا گیا۔لیتھ نے بڑے پیمانے پر اسمبلی N50 کو دوسرے لانگ ریڈ اسمبلی ٹولز کے مقابلے میں 1.6 سے 4 گنا اور ہائبرڈ اسمبلی ٹولز کے مقابلے میں 2 سے 9 گنا بہتر کیا۔12 بیکٹیریل جینوموں میں سے، سات کو سنگل کونٹیگز میں جمع کیا گیا تھا (شکل 3. سیاہ نقطے والے سرکوس)۔مزید تین کو چار یا اس سے کم کنٹیگس میں جمع کیا گیا تھا، جس میں سب سے زیادہ نامکمل اسمبلی میں ایک ہی کانٹیگ میں جینوم کا 83٪ ہوتا تھا۔
چترا 3۔ جینوم کی اسمبلیاں 12 پرجاتیوں کے بیکٹیریل مرکب میں
پاخانہ کے نمونوں میں لیتھ کا استعمال
یہ طریقہ انسانی پاخانہ کے نمونوں پر مزید لاگو کیا گیا تھا تاکہ حیاتیات کی شناخت اور اسمبلی کی مطابقت کا موجودہ طریقوں، ریڈ کلاؤڈ اور شارٹ ریڈ پر مبنی تجزیہ سے موازنہ کیا جا سکے۔شامل تین نمونوں سے، نئے انزائم پر مبنی نکالنے سے کم از کم 1 μg فی 300 ملی گرام ان پٹ ماس حاصل ہوا۔ان HMW DNA کی نینو پور کی ترتیب نے بالترتیب 4.7 kb، 3.0kb اور 3.0kb کے N50 کے ساتھ لانگ ریڈز تیار کیے۔خاص طور پر، موجودہ طریقہ کار نے موجود طریقوں کے مقابلے میں مائکروبیل کا پتہ لگانے میں بڑی صلاحیت ظاہر کی ہے۔شارٹ ریڈ اور ریڈ کلاؤڈ کے مقابلے میں نسبتاً زیادہ پرجاتیوں کی سطح کے الفا تنوع کو دکھایا گیا تھا۔مزید برآں، مختصر پڑھے جانے والے تجزیے سے تمام نسلیں، یہاں تک کہ عام طور پر lysis کے خلاف مزاحمت کرنے والے گرام پازیٹو جاندار بھی، اس طریقہ سے بازیافت ہوئے۔
شکل 4. الفا تنوع اور ٹیکسانومک اجزاء جو نانو پور کے ذریعے طے کیے جاتے ہیں، مختصر پڑھنے اور پڑھنے کے کلاؤڈ طریقے
خام ڈیٹا کے تین سے چھ گنا کم ان پٹ کے باوجود، خراد نے شارٹ ریڈ اور ریڈ کلاؤڈ اسمبلی کے مقابلے میں پوری اسمبلی N50 زیادہ لمبا حاصل کیا۔ڈرافٹ جینوم کو کنٹیگ بائننگ کے ذریعے تیار کیا گیا تھا، جس میں مسودوں کو مکمل، آلودگی، سنگل کاپی کور جینز وغیرہ کی بنیاد پر "اعلیٰ معیار" یا "جزوی" میں درجہ بندی کیا گیا تھا۔ مختصر پڑھنے اور پڑھنے کے لیے کلاؤڈ۔
شکل 5۔ ہر طریقہ کار کی فی آرگنزم اسمبلی کی مطابقت
مزید یہ کہ موجودہ اسمبلی اپروچ بند، سرکلر جینوم حاصل کرنے کے قابل ہے۔پاخانہ کے نمونوں میں، آٹھ اعلیٰ معیار کے، سنگل کونٹیگ جینومز کو جمع کیا گیا اور ان میں سے پانچ نے درست گردش حاصل کی۔طویل پڑھے جانے والے نقطہ نظر نے جینوم میں دہرائے جانے والے عناصر کو حل کرنے میں بھی متاثر کن صلاحیت کا مظاہرہ کیا۔سرکلرائزڈپی کوپریجینوم اس نقطہ نظر کے ذریعہ تیار کیا گیا تھا ، جس میں تسلسل کی تکرار کی اعلی ڈگری پر مشتمل جانا جاتا ہے۔شارٹ ریڈ اور ریڈ کلاؤڈ کے ذریعہ اس جینوم کی بہترین اسمبلی کبھی بھی 130 kb کے N50 سے زیادہ نہیں ہوئی، یہاں تک کہ 4800X کی کوریج کی گہرائی کے ساتھ۔یہ اعلی کاپی نمبر عناصر کو طویل پڑھنے والے نقطہ نظر سے مکمل طور پر حل کیا گیا تھا، جو اکثر شارٹ ریڈ یا ریڈ کلاؤڈ اسمبلیوں کے بریکنگ پوائنٹس پر پایا جاتا ہے۔اس تحقیق میں ایک اور بند جینوم کی اطلاع دی گئی تھی، جس کے بارے میں خیال کیا جاتا تھا کہ حال ہی میں بیان کیا گیا ہے۔سیبیوبیکٹرcladeاس بند اسمبلی میں 8.5 سے 65.9 kb کے درمیان پانچ پوٹیٹو فیز کی نشاندہی کی گئی۔
تصویر 6. P.copri اور Cibiobacter sp کے بند جینوم کا سرکوس ڈایاگرام۔
حوالہ
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020)۔نینو پور کی ترتیب کا استعمال کرتے ہوئے مائکرو بایوم سے مکمل، بند بیکٹیریل جینوم۔نیچر بائیو ٹیکنالوجی،38(6)، 701-707۔
ٹیک اور ہائی لائٹس جس کا مقصد مختلف تحقیقی میدانوں میں مختلف ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کے حالیہ کامیاب اطلاق کے ساتھ ساتھ تجرباتی ڈیزائن اور ڈیٹا مائننگ میں شاندار خیالات کا اشتراک کرنا ہے۔
پوسٹ ٹائم: جنوری 07-2022