METAGENOMIK
Konplete, fèmen jenom bakteri ki soti nan mikrobyom lè l sèvi avèk sekans nanopore
Nanopore Sekans |Metagenomics |MAGs |Bakteri genomic sikilasyon |Miwobiot zantray
Pwen esansyèl
1. Yon nouvo metòd pou ekstrè fragman long nan ADN te prezante nan etid sa a, ki te reyalize ekstraksyon nan mikwogram nan pi bon kalite, HMW ADN apwopriye pou sekans long li soti nan 300 mg nan poupou.
2.Yon travay asanble, Lathe, te prezante nan etid sa a, kote MAG yo te rasanble pa lekti long ak korije pa lekti kout.
3.Lathe te evalye pa melanj mock.7 sou 12 bakteri yo te reyini avèk siksè nan yon sèl kontig epi 3 yo te rasanble nan kat oswa mwens kontig.
4.Lathe te plis aplike nan echantiyon poupou, ki te pwodwi 20 sikilè genòm, ki gen ladan Prevotella copri ak kandida Cibiobacter sp., ki te konnen pou yo te rich nan eleman jenetik mobil.
Akonplisman prensipal la
Pwotokòl ekstraksyon pou ADN HWM
Long-li sekans ki baze sou syans metagenomic zantray yo te soufri depi lontan nan dite nan ekstrè gwo pwa molekilè (HMW) ADN nan poupou.Nan etid sa a, yo te entwodui yon pwotokòl ekstraksyon ki baze sou anzim pou fè pou evite gwo taye lenn pa bat chaplèt nan metòd tradisyonèl yo.Jan yo montre nan figi sa a, echantiyon yo te premyèman trete ak yon bwason nan anzim, ki gen ladan anzim litik, MetaPolyzyme, elatriye pou degrade mi selil yo.ADN lage te ekstrè pa sistèm Phenol-chloroform, ki te swiv pa dijesyon Proteinase K ak RNase A, pirifikasyon ki baze sou kolòn ak seleksyon gwosè SPRI.Metòd sa a jere bay mikwogram ADN HMW soti nan 300 m nan poupou, ki satisfè kondisyon sekans long li an tèm de kalite ak kantite.
Figi 1. Konplo ekstraksyon ADN HWM
Koule Scheme nan Thorne
Jan sa dekri nan figi sa a, Thorne gen pwosesis ki egziste deja nan pwosesis baz kri lè l sèvi avèk Guppy.Lè sa a, Flye ak Canu pwodwi de asanble ki long li yo separeman ki te swiv pa deteksyon ak retire move asanble.De sou-asanble yo fizyone ak quickmerge.Lè yo fin fè fusion, yo tcheke gwo asanble yo nan nivo megabaz yo pou silarizasyon.Apre sa, rafineman konsansis sou asanble sa yo trete ak lekti kout.Yo trete genòm final bakteri yo pou deteksyon final mis-asanble ak retire.
Figi 2. Koule Scheme asanble tour
Evalyasyon Thorne ak melanj mock bakteri
Yon melanj estanda ATCC 12-espès ki gen ladan tou de bakteri Gram-pozitif ak Gram-negatif te anplwaye pou evalye pèfòmans nan platfòm sekans nanopore ak Thorne nan asanble MAG.Yon total de done 30.3 Gb te pwodwi pa platfòm nanopore ak N50 nan 5.9 kb.Tour lajman amelyore asanble N50 a 1.6 a 4-pliye konpare ak lòt zouti asanble ki long li ak 2 a 9-pliye konpare ak zouti asanble ibrid.Nan 12 jenom bakteri, sèt yo te rasanble nan yon sèl kontig (Figi 3. Circos ak pwen nwa).Twa plis yo te rasanble nan kat oswa mwens kontig, nan ki asanble ki pi enkonplè a te genyen 83% nan genòm nan yon sèl kontig.
Figi 3. Asanble jenom nan yon melanj bakteri defini 12-espès
Aplikasyon Thorne nan echantiyon poupou
Metòd sa a te aplike plis pou echantiyon poupou moun yo nan lòd yo konpare idantifikasyon an òganis ak kontigwite asanble a metòd ki egziste deja, lekti-nwaj ak analiz ki baze sou kout lekti.Soti nan twa echantiyon ki enplike, nouvo ekstraksyon ki baze sou anzim la bay omwen 1 μg pou chak 300 mg mas opinyon.Nanopore sekans ADN HMW sa yo te pwodwi lekti long ak N50 nan 4.7 kb, 3.0kb ak 3.0kb respektivman.Miyò, metòd prezan montre gwo potansyèl nan deteksyon mikwòb konpare ak metòd ki egziste.Relativman pi wo divèsite alfa nan nivo espès yo te montre isit la konpare ak kout-li ak li-nwaj.Anplis, tout jenere ki soti nan analiz kout lekti, menm tipikman lysis ki reziste òganis Gram-pozitif, yo te refè pa metòd sa a.
Figi 4. Divèsite alfa ak konpozan taksomik yo detèmine pa Nanopore, metòd pou lekti kout ak nwaj li yo.
Tour bay N50 antye-asanble pi lontan pase asanble kout-lekti ak li-nwaj, malgre yon antre twa a sis fwa pi ba nan done anvan tout koreksyon.Draft genomes te pwodwi pa contig binning, nan ki bouyon yo te klase nan "wo kalite" oswa "pasyèl" ki baze sou konplè, kontaminasyon, yon sèl-kopi jèn nwayo, elatriye. nan kout-li ak li-nwaj.
Figi 5. Kontiguite asanble chak òganis nan chak metòd
Anplis, apwòch asanble prezan se kapab bay genòm fèmen, sikilè.Nan echantiyon poupou yo, uit-wo kalite, sèl-kontig genom yo te reyini ak senk nan sa yo reyalize sirkularizasyon percise.Apwòch ki long li tou montre kapasite enpresyonan nan rezoud eleman repetitif nan genòm.SikilarizeP. coprite genomic ki te pwodwi pa apwòch sa a, ki te konnen ki genyen segondè-degre repetisyon sekans.Asanble a pi bon nan genomic sa a pa kout-li ak li-nwaj pa janm depase N50 nan 130 kb, menm ak pwofondè pwoteksyon nan 4800X.Eleman nimewo kopi segondè sa yo te konplètman rezoud pa apwòch long-lecture, ki souvan yo te jwenn nan pwen rupture nan asanble kout-li oswa li-nwaj.Yon lòt genomic fèmen te rapòte nan etid sa a, ki te kwè yo dwe yon manm nan dènyèman dekriCibiobacterclade.Senk faj potatif te idantifye nan asanble fèmen sa a, sòti nan 8.5 a 65.9 kb.
Figi 6. Dyagram Circos nan genòm fèmen nan P.copri ak Cibiobacter sp.
Referans
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Konplete, fèmen jenom bakteri ki soti nan mikrobyom lè l sèvi avèk sekans nanopore.Bioteknoloji nati,38(6), 701-707.
Teknoloji ak Pwen esansyèl vize nan pataje aplikasyon ki pi resan siksè nan diferan teknoloji sekans segondè-debi nan divès tèren rechèch kòm byen ke lide briyan nan konsepsyon eksperimantal ak done min.
Lè poste: Jan-07-2022