ΜΕΤΑΓΕΝΩΜΙΚΗ
Πλήρη, κλειστά βακτηριακά γονιδιώματα από μικροβιώματα με χρήση αλληλουχίας νανοπόρου
Αλληλουχία νανοπόρων |Μεταγονιδιωματική |MAGs |Κυκλοφορία βακτηριακού γονιδιώματος |Μικροβίωση του εντέρου
Καλύτερες στιγμές
1.Μια νέα μέθοδος για την εξαγωγή μακριών θραυσμάτων DNA παρουσιάστηκε σε αυτή τη μελέτη, η οποία πέτυχε την εκχύλιση μικρογραμμαρίων καθαρού DNA HMW κατάλληλου για μακροχρόνια ανάλυση αλληλουχίας από 300 mg κοπράνων
2. Μια ροή εργασιών συναρμολόγησης, ο Τόρνος, εισήχθη σε αυτή τη μελέτη, όπου τα MAG συναρμολογήθηκαν με μεγάλες αναγνώσεις και διορθώθηκαν με σύντομες αναγνώσεις.
3. Ο τόρνος αξιολογήθηκε με εικονικό μίγμα.7 από τα 12 βακτήρια συναρμολογήθηκαν επιτυχώς σε μεμονωμένα contigs και 3 συγκεντρώθηκαν σε τέσσερα ή λιγότερα contigs.
4. Ο τόρνος εφαρμόστηκε περαιτέρω σε δείγματα κοπράνων, τα οποία δημιούργησαν 20 κυκλοποιημένα γονιδιώματα, συμπεριλαμβανομένων των Prevotella copri και του υποψήφιου Cibiobacter sp., οι οποίες ήταν γνωστές ως πλούσιες σε κινητά γενετικά στοιχεία.
Κύριο επίτευγμα
Πρωτόκολλο εκχύλισης για HWM DNA
Οι μακροχρόνιες μελέτες μεταγονιδιωματικών εντερικών με βάση την αλληλουχία έχουν υποστεί επί μακρόν σκληρότητα στην εξαγωγή DNA υψηλού μοριακού βάρους (HMW) από τα κόπρανα.Σε αυτή τη μελέτη, εισήχθη ένα πρωτόκολλο εκχύλισης με βάση το ένζυμο για να αποφευχθεί η εκτεταμένη διάτμηση με χτύπημα σφαιριδίων με παραδοσιακές μεθόδους.Όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα, τα δείγματα κατεργάστηκαν αρχικά με ένα κοκτέιλ ενζύμων, συμπεριλαμβανομένου του λυτικού ενζύμου, του MetaPolyzyme, κ.λπ. για την αποικοδόμηση των κυτταρικών τοιχωμάτων.Το απελευθερωμένο DNA εκχυλίστηκε με σύστημα φαινόλης-χλωροφορμίου, ακολουθούμενο από πέψη πρωτεϊνάσης Κ και RNase A, καθαρισμό με βάση τη στήλη και επιλογή μεγέθους SPRI.Αυτή η μέθοδος κατάφερε να αποδώσει μικρογραμμάρια HMW DNA από 300 m κόπρανα, τα οποία πληρούν τις απαιτήσεις αλληλουχίας που έχουν αναγνωσθεί μακροπρόθεσμα ως προς την ποιότητα και την ποσότητα.
Εικόνα 1. Σχέδιο εξαγωγής DNA HWM
Σχέδιο ροής Τόρνου
Όπως περιγράφεται στο παρακάτω σχήμα, ο Τόρνος περιέχει την υπάρχουσα διαδικασία ακατέργαστης βασικής κλήσης με χρήση Guppy.Στη συνέχεια παράγονται δύο συγκροτήματα μακράς ανάγνωσης από την Flye και την Canu ξεχωριστά, ακολουθούμενα από ανίχνευση και αφαίρεση λανθασμένης συναρμολόγησης.Τα δύο υποσυστήματα συγχωνεύονται με τη γρήγορη συγχώνευση.Κατά τη συγχώνευση, τα μεγάλα συγκροτήματα σε επίπεδο megabase ελέγχονται στη συνέχεια για κυκλοποίηση.Στη συνέχεια, η συναινετική βελτίωση σε αυτές τις συναρμολογήσεις υποβάλλεται σε επεξεργασία με σύντομες αναγνώσεις.Τα τελικά συναρμολογημένα βακτηριακά γονιδιώματα υποβάλλονται σε επεξεργασία για την τελική ανίχνευση και απομάκρυνση της εσφαλμένης συναρμολόγησης.
Εικόνα 2. Σχέδιο ροής του συγκροτήματος Τόρνου
Αξιολόγηση Τόρνου με μικτό μίγμα βακτηρίων
Χρησιμοποιήθηκε ένα τυπικό μείγμα 12 ειδών ATCC που περιλαμβάνει τόσο Gram-θετικά όσο και Gram-αρνητικά βακτήρια για την αξιολόγηση της απόδοσης της πλατφόρμας προσδιορισμού αλληλουχίας νανοπόρων και του Τόρνου στη διάταξη MAG.Συνολικά 30,3 Gb δεδομένα δημιουργήθηκαν από πλατφόρμα νανοπόρου με N50 5,9 kb.Ο τόρνος βελτίωσε σε μεγάλο βαθμό τη διάταξη N50 σε 1,6 έως 4 φορές σε σύγκριση με άλλα εργαλεία συναρμολόγησης με μεγάλη ανάγνωση και 2 έως 9 φορές σε σύγκριση με τα υβριδικά εργαλεία συναρμολόγησης.Από 12 βακτηριακά γονιδιώματα, τα επτά συναρμολογήθηκαν σε μεμονωμένα contigs (Εικόνα 3. Circos με μαύρη κουκκίδα).Τρεις ακόμη συγκεντρώθηκαν σε τέσσερα ή λιγότερα contigs, στα οποία το πιο ατελές συγκρότημα περιείχε το 83% του γονιδιώματος σε ένα μόνο contig.
Σχήμα 3. Συγκροτήματα γονιδιώματος σε ένα καθορισμένο βακτηριακό μίγμα 12 ειδών
Εφαρμογή Τόρνου σε δείγματα κοπράνων
Αυτή η μέθοδος εφαρμόστηκε περαιτέρω σε δείγματα ανθρώπινων κοπράνων προκειμένου να συγκριθεί η αναγνώριση και η γειτνίαση του οργανισμού με τις υπάρχουσες μεθόδους, ανάλυση με βάση το νέφος ανάγνωσης και τη σύντομη ανάγνωση.Από τα τρία δείγματα που συμμετέχουν, η νέα εκχύλιση με βάση τα ένζυμα απέδωσε τουλάχιστον 1 μg ανά 300 mg εισερχόμενης μάζας.Η αλληλουχία νανοπόρων αυτών των HMW DNA δημιούργησε μακροχρόνιες αναγνώσεις με N50 4,7 kb, 3,0 kb και 3,0 kb αντίστοιχα.Σημειωτέον, η παρούσα μέθοδος έδειξε μεγάλες δυνατότητες στην ανίχνευση μικροβίων σε σύγκριση με τις υπάρχουσες μεθόδους.Εδώ εμφανίστηκε σχετικά υψηλότερη άλφα ποικιλομορφία σε επίπεδο είδους σε σύγκριση με τη σύντομη ανάγνωση και το σύννεφο ανάγνωσης.Επιπλέον, όλα τα γένη από ανάλυση σύντομης ανάγνωσης, ακόμη και τυπικά ανθεκτικοί στη λύση οργανισμοί θετικοί κατά Gram, ανακτήθηκαν με αυτή τη μέθοδο.
Σχήμα 4. Ποικιλότητα άλφα και ταξινομικές συνιστώσες που προσδιορίζονται με μεθόδους Nanopore, σύντομης ανάγνωσης και ανάγνωσης-σύννεφου
Ο τόρνος απέδωσε πολύ μακρύτερο σύνολο N50 από το συγκρότημα βραχείας ανάγνωσης και ανάγνωσης-σύννεφου, παρά την κατά τρεις έως έξι φορές χαμηλότερη εισαγωγή ακατέργαστων δεδομένων.Τα προσχέδια γονιδιώματα παράγονται με συνεχή δέσμευση, στην οποία τα προσχέδια ταξινομήθηκαν σε "υψηλής ποιότητας" ή "μερική" με βάση την πληρότητα, τη μόλυνση, τα γονίδια πυρήνα ενός αντιγράφου, κ.λπ. Η συναρμολόγηση με μεγάλη ανάγνωση έδειξε πολύ μεγαλύτερη γειτνίαση με χαμηλότερο κόστος σε σύγκριση για σύντομη ανάγνωση και ανάγνωση-σύννεφο.
Εικόνα 5. Γειτονιά συγκροτήματος ανά οργανισμό κάθε μεθόδου
Επιπλέον, η παρούσα προσέγγιση συναρμολόγησης είναι ικανή να αποδώσει κλειστά, κυκλικά γονιδιώματα.Στα δείγματα κοπράνων, συναρμολογήθηκαν οκτώ υψηλής ποιότητας γονιδιώματα μονής σύγκρουσης και πέντε από αυτά πέτυχαν ακριβή κυκλοποίηση.Η μακροχρόνια προσέγγιση έδειξε επίσης εντυπωσιακή ικανότητα στην επίλυση επαναλαμβανόμενων στοιχείων στα γονιδιώματα.ΚυκλοφορήθηκεΡ. copriΤο γονιδίωμα δημιουργήθηκε με αυτήν την προσέγγιση, η οποία είναι γνωστό ότι περιέχει υψηλού βαθμού επανάληψη αλληλουχίας.Η καλύτερη συναρμολόγηση αυτού του γονιδιώματος από σύννεφο σύντομης ανάγνωσης και ανάγνωσης δεν ξεπέρασε ποτέ το N50 των 130 kb, ακόμη και με βάθος κάλυψης 4800Χ.Αυτά τα στοιχεία υψηλού αριθμού αντιγράφων επιλύθηκαν πλήρως με προσέγγιση μακράς ανάγνωσης, η οποία συχνά συναντάται σε σημεία διακοπής συναρμολογήσεων σύννεφων σύννεφων ανάγνωσης ή ανάγνωσης.Ένα άλλο κλειστό γονιδίωμα αναφέρθηκε σε αυτή τη μελέτη, το οποίο πιστεύεται ότι είναι μέλος της πρόσφατα περιγραφείσαςCibiobacterclade.Πέντε πιθανοί φάγοι ταυτοποιήθηκαν σε αυτό το κλειστό συγκρότημα, που κυμαίνονται από 8,5 έως 65,9 kb.
Εικόνα 6. Διάγραμμα Circos κλειστών γονιδιωμάτων των P.copri και Cibiobacter sp.
Αναφορά
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Πλήρη, κλειστά βακτηριακά γονιδιώματα από μικροβιώματα με χρήση αλληλουχίας νανοπόρου.Βιοτεχνολογία της φύσης,38(6), 701-707.
Tech and Highlights στοχεύει στην κοινή χρήση των πιο πρόσφατων επιτυχημένων εφαρμογών διαφορετικών τεχνολογιών αλληλουχίας υψηλής απόδοσης σε διάφορους τομείς έρευνας καθώς και λαμπρών ιδεών στον πειραματικό σχεδιασμό και την εξόρυξη δεδομένων.
Ώρα δημοσίευσης: Ιαν-07-2022