METAGENOMICS
Kompletné, uzavreté bakteriálne genómy z mikrobiómov pomocou sekvenovania nanopórov
Sekvenovanie nanopórov |Metagenomika |MAGs |Cirkularizácia bakteriálneho genómu |Črevná mikroflóra
Zvýraznenie
1. V tejto štúdii bola prezentovaná nová metóda extrakcie dlhých fragmentov DNA, ktorá dosiahla extrakciu mikrogramov čistej, HMW DNA vhodnej na dlhé sekvenovanie z 300 mg stolice
2. V tejto štúdii bol zavedený montážny pracovný postup, sústruh, kde boli MAG zostavené dlhým čítaním a opravené krátkym čítaním.
3. Sústruh bol hodnotený falošnou zmesou.7 z 12 baktérií bolo úspešne zostavených do jednotlivých kontigov a 3 boli zostavené do štyroch alebo menej kontigov.
4. Sústruh bol ďalej aplikovaný na vzorky stolice, ktoré generovali 20 kruhových genómov, vrátane Prevotella copri a kandidáta Cibiobacter sp., ktoré boli známe tým, že sú bohaté na mobilné genetické prvky.
Hlavný úspech
Extrakčný protokol pre HWM DNA
Metagenomické štúdie čreva založené na dlhom čítaní sekvencovania už dlho trpia tvrdosťou pri extrakcii DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou (HMW) zo stolice.V tejto štúdii bol zavedený protokol extrakcie na báze enzýmov, aby sa predišlo rozsiahlemu strihu bitím guľôčok pri tradičných metódach.Ako je znázornené na nasledujúcom obrázku, vzorky boli najprv ošetrené kokteilom enzýmov, vrátane lytického enzýmu, MetaPolyzymu atď., aby sa degradovali bunkové steny.Uvoľnená DNA sa extrahovala systémom fenol-chloroform, nasledovalo štiepenie proteinázou K a RNázou A, čistenie na kolóne a výber veľkosti SPRI.Touto metódou sa podarilo získať mikrogramy HMW DNA z 300 m stolice, čo spĺňa požiadavky na dlhodobé sekvenovanie z hľadiska kvality aj kvantity.
Obrázok 1. Schéma extrakcie HWM DNA
Schéma toku sústruhu
Ako je popísané na nasledujúcom obrázku, sústruh obsahuje existujúci proces surového basecallingu pomocou Guppy.Flye a Canu potom samostatne vyrobia dve zostavy s dlhým čítaním, po ktorých nasleduje detekcia nesprávneho zostavenia a odstránenie.Dve podzostavy sa zlúčia pomocou rýchleho spojenia.Po zlúčení sa potom veľké zostavy na úrovni megabáz skontrolujú na cirkularizáciu.Následne sa spresnenie konsenzu na týchto zostavách spracuje krátkym čítaním.Konečné zostavené bakteriálne genómy sa spracujú na konečnú detekciu nesprávneho zostavenia a odstránenie.
Obrázok 2. Schéma toku zostavy sústruhu
Hodnotenie sústruhu so zmesou falošných baktérií
Na vyhodnotenie výkonu platformy na sekvenovanie nanopórov a sústruhu v zostave MAG sa použila štandardná zmes ATCC 12 druhov obsahujúca grampozitívne aj gramnegatívne baktérie.Celkovo 30,3 Gb dát vygenerovala nanopore platforma s N50 5,9 kb.Sústruh výrazne zlepšil montáž N50 na 1,6 až 4-násobok v porovnaní s inými montážnymi nástrojmi s dlhým čítaním a 2 až 9-násobok v porovnaní s hybridnými montážnymi nástrojmi.Z 12 bakteriálnych genómov bolo sedem zostavených do jednotlivých kontigov (obrázok 3. Circos s čiernou bodkou).Tri ďalšie boli zostavené do štyroch alebo menej kontigov, v ktorých najnekompletnejšia zostava obsahovala 83 % genómu v jednom kontigu.
Obrázok 3. Zostavy genómu v definovanej 12-druhovej bakteriálnej zmesi
Aplikácia sústruhu vo vzorkách stolice
Táto metóda bola ďalej aplikovaná na vzorky ľudskej stolice, aby sa porovnala identifikácia organizmu a súvislosť zostavy s existujúcimi metódami, analýzou založenou na cloude a analýze založenej na krátkom čítaní.Z troch zahrnutých vzoriek nová enzýmová extrakcia poskytla najmenej 1 μg na 300 mg vstupnej hmoty.Sekvenovanie nanopórov týchto HMW DNA generovalo dlhé čítania s N50 s veľkosťou 4,7 kb, 3,0 kb a 3,0 kb.Predovšetkým súčasný spôsob ukázal veľký potenciál v mikrobiálnej detekcii v porovnaní s existujúcimi metódami.V porovnaní s krátkym čítaním a čítacím cloudom sa tu ukázala relatívne vyššia druhová diverzita alfa.Okrem toho sa touto metódou získali všetky rody z analýzy krátkeho čítania, dokonca aj typicky grampozitívne organizmy odolné voči lýze.
Obrázok 4. Alfa diverzita a taxanomické zložky určené metódami Nanopore, short-read a read-cloud
Sústruh priniesol oveľa dlhšiu celú zostavu N50 ako zostava na krátke čítanie a čítanie v cloude, a to aj napriek troj- až šesťnásobne nižšiemu vstupu nespracovaných údajov.Návrhy genómov boli vytvorené metódou contig binning, v ktorej boli koncepty klasifikované ako „vysokokvalitné“ alebo „čiastočné“ na základe úplnosti, kontaminácie, génov s jednou kópiou atď. na short-read a read-cloud.
Obrázok 5. Súvislosť zostavy podľa organizmu každej metódy
Okrem toho je súčasný prístup zostavovania schopný poskytnúť uzavreté kruhové genómy.Vo vzorkách stolice sa zhromaždilo osem vysokokvalitných jednokontigových genómov a päť z nich dosiahlo presnú cirkularizáciu.Prístup dlhého čítania tiež ukázal pôsobivú kapacitu pri riešení opakujúcich sa prvkov v genómoch.CircularizedP. coprigenóm bol vytvorený týmto prístupom, o ktorom je známe, že obsahuje vysoký stupeň opakovania sekvencií.Najlepšie zostavenie tohto genómu krátkym čítaním a čítacím cloudom nikdy neprekročilo N50 130 kb, dokonca aj s hĺbkou pokrytia 4800X.Tieto prvky s vysokým počtom kópií boli plne vyriešené prístupom dlhého čítania, ktorý sa často nachádzal v zlomových bodoch zostáv krátkeho čítania alebo čítania.V tejto štúdii bol zaznamenaný ďalší uzavretý genóm, o ktorom sa predpokladalo, že je členom nedávno opísanéhoCibiobacterklad.V tejto uzavretej zostave bolo identifikovaných päť domnelých fágov v rozsahu od 8,5 do 65,9 kb.
Obrázok 6. Circos diagram uzavretých genómov P.copri a Cibiobacter sp.
Odkaz
Moss, EL, Maghini, DG a Bhatt, AS (2020).Kompletné, uzavreté bakteriálne genómy z mikrobiómov pomocou sekvenovania nanopórov.Prírodná biotechnológia,38(6), 701-707.
Tech and Highlights sa zameriava na zdieľanie najnovších úspešných aplikácií rôznych vysokovýkonných sekvenčných technológií v rôznych oblastiach výskumu, ako aj skvelých nápadov v experimentálnom dizajne a dolovaní údajov.
Čas odoslania: Jan-07-2022