METAGENOMIKA
Nanoporoen sekuentziazioa erabiliz mikrobiometako bakterioen genoma osoak eta itxiak
Nanoporoen Sekuentziazioa |Metagenomika |MAGak |Bakterioen genomaren zirkularizazioa |Hesteetako mikrobiota
Nabarmenak
1. Azterketa honetan DNA zati luzeak ateratzeko metodo berri bat aurkeztu zen, HMW DNA puruaren mikrogramoa ateratzea lortu zuen, irakurketa luzerako sekuentziaziorako egokia den 300 mg gorotzetatik.
2.Ikerlan honetan muntaketa-fluxu bat, Tornua, sartu zen, non MAG-ak irakurketa luzeen bidez muntatzen ziren eta irakurketa laburren bidez zuzendu ziren.
3. Tornua nahaste simulatuaren bidez ebaluatu zen.12 bakteriotik 7 arrakastaz muntatu ziren kontig bakar batean eta 3 lau kontig edo gutxiagotan muntatu ziren.
4.Tornua gehiago aplikatu zen taburete-laginei, eta 20 genoma zirkularizatu sortu ziren, Prevotella copri eta Cibiobacter sp hautagaia barne., elementu genetiko mugikorretan aberatsak zirelako ezagunak zirenak.
Lorpen Nagusia
HWM DNAren erauzketa-protokoloa
Irakurri luzeko sekuentziazioan oinarritutako hesteetako metagenomiko ikerketek gogortasuna jasan dute pisu molekular handiko (HMW) DNA gorotzetatik erauzteko.Ikerketa honetan, entzimetan oinarritutako erauzketa-protokolo bat sartu zen metodo tradizionaletan aleak irabiatzearen bidez zizaila handia saihesteko.Hurrengo irudian ikusten den bezala, laginak lehenik entzima koktel batekin tratatu ziren, besteak beste, entzima litikoa, MetaPolyzyme, etab. zelularen paretak degradatzeko.Askatutako DNA Fenol-kloroformo sistemaren bidez atera zen, eta ondoren Proteinasa K eta RNasa A digestioa, zutabeetan oinarritutako arazketa eta SPRI tamaina hautatzea.Metodo honek HMW DNAren mikrogramoak ateratzea lortu zuen 300 m-ko gorotzetatik, irakurketa luzeko sekuentziazio-eskakizunak betetzen baititu kalitatearen eta kantitatearen aldetik.
1. Irudia. HWM DNA erauzteko eskema
Tornuaren fluxu eskema
Hurrengo irudian deskribatzen den bezala, Tornuak lehendik dagoen oinarrizko dei-prozesuaren prozesua dauka Guppy erabiliz.Ondoren, Flye-k eta Canu-k banan-banan ekoizten dituzte irakurketa luzeko bi muntaketa eta, ondoren, gaizki-muntaiak hautematen eta kentzen dituzte.Bi azpimultzoak batu egiten dira quickmergerekin.Bateratzean, megabase-mailako muntaia handiak zirkularizazioa egiaztatzen dira.Ondoren, batzar hauei buruzko adostasuna finkatzea irakurketa laburrekin prozesatzen da.Azken muntatutako bakterioen genomak prozesatzen dira azken muntaketa okerrak detektatzeko eta kentzeko.
2. Irudia Tornuaren muntaketaren fluxu eskema
Tornuaren ebaluazioa bakterio nahasketa simulatuarekin
Nanoporoen sekuentziazio-plataformaren eta tornuaren errendimendua ebaluatzeko, bakterio Gram-positibo eta Gram-negatiboekin osatutako ATCC 12 espezieko nahasketa estandar bat erabili zen MAG muntaian.Guztira 30,3 Gb-ko datu sortu ditu nanopore plataformak 5,9 kb-ko N50-arekin.Tornuak, neurri handi batean, N50 muntaketa hobetu du 1,6 eta 4 aldiz, irakurketa luzeko beste muntaketa-tresnekin alderatuta, eta 2-9 aldiz, muntaketa-tresn hibridoekin alderatuta.12 bakterio genometatik zazpi kontig bakar batean bildu ziren (3. irudia. Puntu beltza duten zirkuak).Beste hiru lau kontig edo gutxiagotan bildu ziren, eta horietan muntaketa osatugabeenak genomaren % 83 zuen kontig bakar batean.
3. Irudia. Genoma-multzoak definitutako 12 espezietako bakterio-nahaste batean
Tornuaren aplikazioa taburete-laginetan
Metodo hau gizakien gorotz laginetan aplikatu zen, organismoaren identifikazioa eta muntaketaren ondokotasuna lehendik dauden metodoekin, irakurketa hodeian eta irakurketa laburrean oinarritutako analisiarekin alderatzeko.Inplikatutako hiru laginetatik, entzimetan oinarritutako erauzketa berriak gutxienez 1 μg eman zuen sarrerako 300 mg-ko masa bakoitzeko.HMW DNA hauen nanoporoen sekuentziazioak irakurketa luzeak sortu zituen 4,7 kb, 3,0 kb eta 3,0 kb-ko N50rekin hurrenez hurren.Nabarmentzekoa, egungo metodoak mikrobioen detekziorako potentzial handia erakutsi zuen lehendik zeuden metodoekin alderatuta.Espezie-mailako alfa-aniztasun nahiko altuagoa erakutsi zen hemen irakurketa laburreko eta irakurketa-hodeiarekin alderatuta.Gainera, irakurketa laburreko analisietatik ateratako genero guztiak, normalean lisiarekiko erresistenteak diren organismo Gram-positiboak ere, metodo honen bidez berreskuratu ziren.
4. Irudia. Nanopore, irakurketa laburreko eta irakurketa-hodeiko metodoen bidez zehaztutako alfa aniztasuna eta osagai taxnomikoak
Tornuak N50 osoko muntaketa askoz ere luzeagoa eman zuen irakurketa laburrean eta irakurketa-hodeian baino, datu gordinen sarrera hiru edo sei aldiz txikiagoa izan arren.Zirriborroen genomak kontig binning bidez ekoizten ziren, eta bertan zirriborroak "kalitate handiko" edo "partziala"tan sailkatu ziren, osotasunean, kutsaduran, kopia bakarreko core geneetan, etab. Irakurri luzeko muntaketak askoz ere ondokotasun handiagoa erakutsi zuen kostu txikiagoarekin alderatuta. irakurketa laburra eta hodeia irakurtzeko.
5. Irudia. Metodo bakoitzaren organismo bakoitzeko muntaketa-kontiguitatea
Gainera, egungo muntaketa-ikuspegiak genoma itxiak eta zirkularrak emateko gai da.Gorotz laginetan, kalitate handiko zortzi genoma kontig bakarrekoak muntatu ziren eta horietako bostek zirkularizazio zehatza lortu zuten.Irakurketa luzeko ikuspegiak ere gaitasun ikaragarria erakutsi zuen genometan elementu errepikakorrak ebazteko.ZirkularizatuaP. copriIkuspegi honen bidez genoma sortu zen, sekuentzia errepikapen maila altua duela jakina dena.Irakurketa laburrean eta irakurketa-hodeiaren bidez genoma honen muntaketarik onenak ez zuen inoiz 130 kb-ko N50 gainditu, nahiz eta 4800X-ko estaldura-sakonera izan.Kopiaren kopuru handiko elementu hauek guztiz ebatzi ziren irakurketa luzeko ikuspegiaren bidez, askotan irakurketa laburreko edo irakurketa-hodeiko muntaien haustura puntuetan aurkitzen dena.Ikerketa honetan beste genoma itxi bat jakinarazi zen, deskribatu berri den kidea zela uste zenaCibiobacterklade.Batzar itxi honetan bost ustezko fago identifikatu ziren, 8,5 eta 65,9 kb bitartekoak.
6. Irudia. P.copri eta Cibiobacter sp.en genoma itxien Circos diagrama.
Erreferentzia
Moss, EL, Maghini, DG eta Bhatt, AS (2020).Nanoporoen sekuentziazioa erabiliz mikrobiometako bakterioen genoma osoak eta itxiak.Naturaren bioteknologia,38(6), 701-707.
Teknologia eta Nabarmenak Errendimendu handiko sekuentziazio-teknologia desberdinen azken aplikazio arrakastatsuena partekatzea du helburu hainbat ikerketa-esparrutan, baita diseinu esperimentaleko eta datu-meatzaritzako ideia bikainak ere.
Argitalpenaren ordua: 2022-07-07