الميتاجينوميات
الجينومات البكتيرية الكاملة والمغلقة من الميكروبات باستخدام تسلسل ثقب النانو
تسلسل النانوبور |ميتاجينوميكس |ماج |تعميم الجينوم البكتيري |جراثيم الأمعاء
يسلط الضوء
1.تم تقديم طريقة جديدة لاستخراج أجزاء طويلة من الحمض النووي في هذه الدراسة، والتي نجحت في استخراج ميكروغرام من الحمض النووي النقي HMW المناسب لتسلسل القراءة الطويلة من 300 ملغ من البراز
2. تم تقديم سير عمل التجميع، المخرطة، في هذه الدراسة، حيث تم تجميع MAGs من خلال القراءات الطويلة وتصحيحها من خلال القراءات القصيرة.
3. تم تقييم المخرطة بواسطة خليط وهمي.تم تجميع 7 بكتيريا من أصل 12 بكتيريا بنجاح في مجموعات مفردة وتم تجميع 3 بكتيريا في أربعة مجموعات أو أقل.
4. تم تطبيق المخرطة أيضًا على عينات البراز، مما أدى إلى توليد 20 جينومًا دائريًا، بما في ذلك Prevotella copri والمرشح Cibiobacter sp.والتي عرفت بغناها بالعناصر الوراثية المتنقلة.
الإنجاز الرئيسي
بروتوكول استخراج الحمض النووي HWM
لقد عانت الدراسات الميتاجينومية المعوية القائمة على التسلسل الطويل منذ فترة طويلة من صلابة في استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW) من البراز.في هذه الدراسة، تم تقديم بروتوكول استخراج قائم على الإنزيم لتجنب القص الواسع النطاق عن طريق الضرب بالخرز بالطرق التقليدية.كما هو مبين في الشكل التالي، تمت معالجة العينات أولاً بمزيج من الإنزيمات، بما في ذلك الإنزيم التحللي، MetaPolyzyme، وما إلى ذلك لتحطيم جدران الخلايا.تم استخراج الحمض النووي المطلق بواسطة نظام الفينول كلوروفورم، يليه هضم البروتيناز K وRNase A، والتنقية القائمة على العمود واختيار حجم SPRI.تمكنت هذه الطريقة من إنتاج ميكروجرامات من الحمض النووي HMW من 300 متر من البراز، وهو ما يلبي متطلبات التسلسل طويل القراءة من حيث الجودة والكمية.
الشكل 1. مخطط استخراج الحمض النووي HWM
تدفق مخطط المخرطة
كما هو موضح في الشكل التالي، تحتوي المخرطة على العملية الحالية لعملية الاتصال الأساسي الخام باستخدام Guppy.يتم بعد ذلك إنتاج مجموعتين طويلتي القراءة بواسطة Flye وCanu بشكل منفصل، متبوعًا باكتشاف سوء التجميع وإزالته.يتم دمج التجميعتين الفرعيتين مع الدمج السريع.عند الدمج، يتم بعد ذلك فحص التجميعات الكبيرة على مستوى القاعدة الضخمة للتأكد من تعميمها.وبعد ذلك، تتم معالجة التنقيح المتفق عليه بشأن هذه التجميعات من خلال قراءات قصيرة.تتم معالجة الجينومات البكتيرية المجمعة النهائية للكشف النهائي عن سوء التجميع وإزالته.
الشكل 2. مخطط تدفق تجميع المخرطة
تقييم المخرطة بخليط البكتيريا الوهمية
تم استخدام خليط قياسي مكون من 12 نوعًا من ATCC يشتمل على بكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام لتقييم أداء منصة تسلسل ثقب النانو والمخرطة في مجموعة MAG.تم إنشاء إجمالي 30.3 جيجا بايت من البيانات بواسطة منصة nanopore مع N50 بحجم 5.9 كيلو بايت.قامت المخرطة بتحسين التجميع N50 إلى حد كبير إلى 1.6 إلى 4 أضعاف مقارنة بأدوات التجميع الأخرى طويلة القراءة ومن 2 إلى 9 أضعاف مقارنة بأدوات التجميع الهجينة.من 12 الجينوم البكتيري، تم تجميع سبعة في contigs واحد (الشكل 3. السيرك مع نقطة سوداء).تم تجميع ثلاثة آخرين في أربعة مجموعات أو أقل، حيث احتوى التجميع غير المكتمل على 83٪ من الجينوم في مجموعة واحدة.
الشكل 3. تجمعات الجينوم في خليط بكتيري محدد مكون من 12 نوعًا
تطبيق المخرطة في عينات البراز
تم تطبيق هذه الطريقة أيضًا على عينات البراز البشري من أجل مقارنة تحديد الكائن الحي وتواصل التجميع مع الأساليب الحالية والتحليل القائم على القراءة السحابية والقراءة القصيرة.من العينات الثلاث المعنية، أنتج الاستخلاص الجديد المعتمد على الإنزيم ما لا يقل عن 1 ميكروغرام لكل 300 ملغ من كتلة المدخلات.أدى تسلسل Nanopore لـ HMW DNA إلى إنشاء قراءات طويلة بـ N50 تبلغ 4.7 كيلو بايت و 3.0 كيلو بايت و 3.0 كيلو بايت على التوالي.والجدير بالذكر أن الطريقة الحالية أظهرت إمكانات كبيرة في الكشف الميكروبي مقارنة بالطرق الموجودة.تم عرض تنوع ألفا أعلى نسبيًا على مستوى الأنواع هنا مقارنةً بالقراءة القصيرة والسحابة المقروءة.علاوة على ذلك، تم استرداد جميع الأجناس من تحليل القراءة القصيرة، حتى الكائنات إيجابية الجرام المقاومة للتحلل، بهذه الطريقة.
الشكل 4. تنوع ألفا والمكونات التصنيفية التي تحددها طرق Nanopore والقراءة القصيرة والقراءة السحابية
أنتجت المخرطة تجميعًا كاملاً N50 أطول بكثير من تجميع القراءة القصيرة والقراءة السحابية، على الرغم من انخفاض مدخلات البيانات الأولية بمقدار ثلاثة إلى ستة أضعاف.تم إنتاج مسودات الجينوم عن طريق contig binning، حيث تم تصنيف المسودات إلى "عالية الجودة" أو "جزئية" على أساس الاكتمال، والتلوث، والجينات الأساسية ذات النسخة الواحدة، وما إلى ذلك. أظهر التجميع طويل القراءة تجاورًا أعلى بكثير بتكلفة أقل مقارنة للقراءة القصيرة والقراءة السحابية.
الشكل 5. تجاور التجمع لكل كائن حي لكل طريقة
علاوة على ذلك، فإن نهج التجميع الحالي قادر على إنتاج جينومات دائرية مغلقة.في عينات البراز، تم تجميع ثمانية جينومات أحادية عالية الجودة، وحققت خمسة منها تعميمًا دقيقًا.أظهر نهج القراءة الطويلة أيضًا قدرة رائعة على حل العناصر المتكررة في الجينومات.معممةP. كوبريتم إنشاء الجينوم من خلال هذا النهج، والذي يُعرف بأنه يحتوي على درجة عالية من تكرار التسلسل.أفضل تجميع لهذا الجينوم من خلال القراءة القصيرة وسحابة القراءة لم يتجاوز أبدًا N50 البالغ 130 كيلو بايت، حتى مع عمق التغطية 4800X.تم حل هذه العناصر ذات الأرقام العالية بشكل كامل من خلال أسلوب القراءة الطويلة، والذي غالبًا ما يتم العثور عليه عند نقاط التوقف في تجميعات القراءة القصيرة أو تجميعات سحابة القراءة.تم الإبلاغ عن جينوم مغلق آخر في هذه الدراسة، والذي يعتقد أنه عضو تم وصفه مؤخرًاسيبيوباكتركليد.تم التعرف على خمس فاجات مفترضة في هذا التجميع المغلق، يتراوح حجمها من 8.5 إلى 65.9 كيلو بايت.
الشكل 6. مخطط سيركوس للجينومات المغلقة لـ P.copri وCibiobacter sp.
مرجع
موس، إل، ماجيني، دي جي، وبات، AS (2020).الجينومات البكتيرية الكاملة والمغلقة من الميكروبات باستخدام تسلسل ثقب النانو.التكنولوجيا الحيوية الطبيعة,38(6)، 701-707.
التكنولوجيا ويسلط الضوء يهدف إلى مشاركة أحدث التطبيقات الناجحة لمختلف تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية في مختلف مجالات البحث بالإضافة إلى الأفكار الرائعة في التصميم التجريبي واستخراج البيانات.
وقت النشر: 07 يناير 2022