METAGENOMICS
Kompleto, sirado nga bacterial genome gikan sa microbiome gamit ang nanopore sequencing
Pagsunodsunod sa Nanopore |Metagenomics |Mga MAG |Bacterial genome circularization |Microbiota sa gut
Mga highlight
1. Usa ka bag-ong pamaagi sa pagkuha sa taas nga mga tipik sa DNA gipresentar niini nga pagtuon, nga nakab-ot ang pagkuha sa microgram nga puro, HMW DNA nga angay alang sa dugay nga pagbasa nga pagkasunodsunod gikan sa 300 mg sa stool
2. Usa ka asembliya nga workflow, Lathe, gipaila niini nga pagtuon, diin ang mga MAG gitigom pinaagi sa taas nga pagbasa ug gitul-id pinaagi sa mubo nga pagbasa.
3. Lathe gi-evaluate pinaagi sa mock mix.7 sa 12 ka bakterya ang malampusong natigom ngadto sa usa ka contigs ug 3 ang natigom ngadto sa upat o mas gamay nga contigs.
4. Lathe ang dugang nga gipadapat sa mga sampol sa stool, nga nakamugna og 20 ka circularized genome, lakip ang Prevotella copri ug kandidato nga Cibiobacter sp., nga nailhan tungod sa pagkadato sa mobile genetic nga mga elemento.
Panguna nga Kalamposan
Extraction protocol alang sa HWM DNA
Ang dugay na nga pagbasa sa sequencing base sa gut metagenomic nga mga pagtuon dugay na nga nag-antus gikan sa katig-a sa pagkuha sa taas nga molekular nga gibug-aton (HMW) nga DNA gikan sa stool.Niini nga pagtuon, usa ka enzyme-based extraction protocol ang gipaila aron malikayan ang halapad nga paggunting pinaagi sa bead beating sa tradisyonal nga mga pamaagi.Sama sa gipakita sa mosunud nga numero, ang mga sample una nga gitambalan sa usa ka cocktail sa mga enzyme, lakip ang lytic enzyme, MetaPolyzyme, ug uban pa aron madaot ang mga dingding sa cell.Ang gipagawas nga DNA gikuha sa Phenol-chloroform nga sistema, gisundan sa Proteinase K ug RNase A nga pagtunaw, paglimpyo nga nakabase sa kolum ug pagpili sa gidak-on sa SPRI.Kini nga pamaagi nakahimo sa paghatag og micrograms sa HMW DNA gikan sa 300 m nga stool, nga nagtuman sa dugay na nga pagbasa nga mga kinahanglanon sa pagkasunodsunod sa mga termino sa kalidad ug gidaghanon.
Hulagway 1. HWM DNA extraction scheme
Scheme flow sa Lathe
Sama sa gihulagway sa mosunod nga numero, ang Lathe naglangkob sa kasamtangan nga proseso sa hilaw nga basecalling nga proseso gamit ang Guppy.Duha ka dugay na nga nabasa nga mga asembliya ang gihimo sa Flye ug Canu nga gilain nga gisundan sa sayup nga pag-assemble nga pagkakita ug pagtangtang.Ang duha ka sub-assemblies gihiusa sa quickmerge.Sa paghiusa, ang dagkong mga asembliya sa lebel sa megabase gisusi alang sa circularization.Pagkahuman, ang pagpino sa konsensus sa kini nga mga asembliya giproseso sa mubo nga pagbasa.Ang kataposang natigom nga mga bacterial genome giproseso para sa kataposang sayop nga pag-assemble nga detection ug pagtangtang.
Figure 2. Scheme flow sa Lathe nga asembliya
Pagtimbang-timbang sa Lathe nga adunay sagol nga mock bacteria
Usa ka sumbanan nga ATCC 12-species nga sagol nga naglangkob sa Gram-positibo ug Gram-negatibo nga bakterya gigamit aron sa pagtimbang-timbang sa pasundayag sa nanopore sequencing platform ug Lathe sa MAG assembly.Usa ka kinatibuk-an nga 30.3 Gb nga datos ang nahimo sa nanopore platform nga adunay N50 nga 5.9 kb.Ang lathe labi nga nagpauswag sa asembliya nga N50 hangtod sa 1.6 hangtod 4 ka pilo kumpara sa uban pang dugay nga nabasa nga mga himan sa asembliya ug 2 hangtod 9 ka pilo kumpara sa hybridd nga mga himan sa pagpupulong.Sa 12 ka bacterial genome, pito ang gi-assemble ngadto sa single contigs(Figure 3. Circos with black dot).Tulo pa ang gitigum sa upat o mas gamay nga contigs, diin ang labing dili kompleto nga asembliya adunay 83% sa genome sa usa ka contig.
Figure 3. Genome assemblies sa gipiho nga 12-species nga bacterial mixture
Paggamit sa Lathe sa mga sample sa bangkito
Kini nga pamaagi dugang nga gigamit sa human stool samples aron sa pagtandi sa organismo pag-ila ug asembliya contiguity sa kasamtangan nga mga pamaagi, read-cloud ug mubo-basa base sa pagtuki.Gikan sa tulo ka mga sample nga nalambigit, ang bag-ong enzyme-based nga extraction nakahatag ug labing menos 1 μg kada 300 mg sa input mass.Ang pagsunud sa Nanopore sa kini nga HMW DNA nakamugna og dugay nga pagbasa nga adunay N50 nga 4.7 kb, 3.0kb ug 3.0kb matag usa.Ilabi na, ang karon nga pamaagi nagpakita nga dako nga potensyal sa microbial detection kumpara sa naglungtad nga mga pamaagi.Ang medyo mas taas nga lebel sa espisye nga pagkalain-lain sa alpha gipakita dinhi kung itandi sa mubo nga pagbasa ug pagbasa sa panganod.Dugang pa, ang tanan nga mga genera gikan sa mubo nga pagbasa nga pagtuki, bisan sa kasagaran nga lysis-resistant nga Gram-positive nga mga organismo, nakuha pinaagi niini nga pamaagi.
Figure 4. Alpha diversity ug taxanomic components nga gitino sa Nanopore, short-read ug read-cloud nga mga pamaagi
Ang lathe naghatag ug mas taas nga whole-assembly nga N50 kay sa mubo nga pagbasa ug read-cloud nga asembliya, bisan pa sa tulo ngadto sa unom ka pilo nga ubos nga input sa hilaw nga datos.Ang draft genome gihimo pinaagi sa contig binning, diin ang mga draft giklasipikar ngadto sa "high-quality" o "partial" base sa pagkakompleto, kontaminasyon, single-copy core genes, ug uban pa. sa mubo nga pagbasa ug pagbasa sa panganod.
Figure 5. Kadugtongan sa kada organismo sa matag pamaagi
Dugang pa, ang karon nga pamaagi sa asembliya adunay katakus nga maghatag sirado, lingin nga mga genome.Sa mga sample sa stool, walo ka taas nga kalidad, single-contig genome ang gitigum ug lima niini nakab-ot ang percise circularization.Ang dugay nga pagbasa nga pamaagi nagpakita usab og impresibong kapasidad sa pagsulbad sa nagbalikbalik nga mga elemento sa mga genome.GisirkularP. copriAng genome namugna pinaagi niini nga pamaagi, nga nahibal-an nga adunay taas nga lebel sa pagsubli sa pagkasunod-sunod.Ang labing kaayo nga asembliya niini nga genome pinaagi sa mubo nga pagbasa ug pagbasa sa panganod wala gyud molapas sa N50 nga 130 kb, bisan sa giladmon sa pagsakup nga 4800X.Kining taas nga mga elemento sa numero sa kopya hingpit nga nasulbad pinaagi sa dugay nga pagbasa nga pamaagi, nga kasagaran makita sa mga break point sa short-read o read-cloud nga mga asembliya.Laing sirado nga genome ang gitaho sa kini nga pagtuon, nga gituohan nga usa ka miyembro sa bag-ong gihulagwayCibiobacterclade.Lima ka putative phage ang giila sa kini nga closed assembly, gikan sa 8.5 hangtod 65.9 kb.
Figure 6. Circos diagram sa closed genome sa P.copri ug Cibiobacter sp.
Reperensya
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Kompleto, sirado nga bacterial genome gikan sa microbiome gamit ang nanopore sequencing.Bioteknolohiya sa kinaiyahan,38(6), 701-707.
Tech ug Highlight nagtumong sa pagpaambit sa pinakabag-o nga malampuson nga aplikasyon sa lain-laing mga high-throughput sequencing nga mga teknolohiya sa nagkalain-laing reseach arena ingon man usab sa hayag nga mga ideya sa eksperimental nga disenyo ug data mining.
Oras sa pag-post: Ene-07-2022