メタゲノミクス
ナノポアシークエンシングを使用したマイクロバイオームからの完全な閉じた細菌ゲノム
ナノポアシーケンシング |メタゲノミクス |MAG |細菌ゲノム環状化 |腸内細菌叢
ハイライト
1. DNAの長い断片を抽出する新しい方法がこの研究で提示され、300 mgの便からロングリードシーケンスに適した純粋なHMW DNAのマイクログラムの抽出が達成されました。
2.この研究では、アセンブリ ワークフローである Lathe が導入され、MAG はロング リードによってアセンブルされ、ショート リードによって修正されます。
3.旋盤は模擬混合により評価されました。12 個の細菌のうち 7 個は単一コンティグに正常に組み立てられ、3 個は 4 個以下のコンティグに組み立てられました。
4.さらに旋盤を便サンプルに適用すると、Prevotella copri および候補 Cibiobacter sp を含む 20 個の環状ゲノムが生成されました。、可動性の遺伝要素が豊富であることで知られていました。
主な実績
HWM DNA の抽出プロトコル
ロングリードシーケンシングに基づく腸メタゲノム研究は、便から高分子量(HMW) DNA を抽出することが難しいという問題に長い間悩まされてきました。この研究では、従来の方法におけるビーズの叩解による広範な剪断を回避するために、酵素ベースの抽出プロトコルが導入されました。次の図に示すように、サンプルはまず、細胞壁を分解するために、溶解酵素、メタポリザイムなどの酵素のカクテルで処理されました。放出された DNA はフェノール - クロロホルム システムによって抽出され、続いてプロテイナーゼ K および RNase A 消化、カラムベースの精製、および SPRI サイズ選択が行われました。この方法により、300 μm の便からマイクログラムの HMW DNA を得ることができました。これは、質と量の両方の点でロングリード シーケンスの要件を満たします。
図 1. HWM DNA 抽出スキーム
旋盤のスキームフロー
次の図に示すように、Lathe には Guppy を使用した生のベースコール処理の既存のプロセスが含まれています。次に、2 つのロングリード アセンブリが Flye と Canu によって別々に生成され、その後、ミスアセンブリが検出されて削除されます。2 つのサブアセンブリはクイックマージでマージされます。マージ時に、メガベース レベルの大規模アセンブリの循環がチェックされます。続いて、これらのアセンブリのコンセンサスの詳細化がショートリードで処理されます。最終的に組み立てられた細菌ゲノムは、最終的な誤った組み立ての検出と除去のために処理されます。
図 2. 旋盤アセンブリのスキーム フロー
模擬菌混入旋盤の評価
グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方を含む標準的な ATCC 12 種混合物を使用して、MAG アセンブリにおけるナノポア配列決定プラットフォームと旋盤の性能を評価しました。合計 30.3 Gb のデータが、N50 5.9 kb のナノポア プラットフォームによって生成されました。旋盤は、アセンブリ N50 を他のロングリード アセンブリ ツールと比較して 1.6 ～ 4 倍、ハイブリッド アセンブリ ツールと比較して 2 ～ 9 倍に大幅に改善しました。12 個の細菌ゲノムのうち、7 個が単一のコンティグに組み立てられました (図 3. 黒い点のある Circos)。さらに 3 つが 4 つ以下のコンティグに組み立てられ、最も不完全なアセンブリには 1 つのコンティグにゲノムの 83% が含まれていました。
図 3. 定義された 12 種の細菌混合物におけるゲノムアセンブリ
便サンプルへの旋盤の応用
この方法はさらに、生物の同定とアセンブリの連続性を既存の方法であるリードクラウドおよびショートリードベースの分析と比較するために、ヒトの便サンプルに適用されました。関与する 3 つのサンプルから、新しい酵素ベースの抽出により、投入質量 300 mg あたり少なくとも 1 μg が得られました。これらの HMW DNA のナノポア シーケンスにより、それぞれ 4.7 kb、3.0 kb、および 3.0 kb の N50 を持つロングリードが生成されました。特に、本発明の方法は、既存の方法と比較して微生物検出において大きな可能性を示した。ここでは、ショートリードおよびリードクラウドと比較して、比較的高い種レベルのアルファ多様性が示されました。さらに、ショートリード分析からのすべての属、典型的には溶解抵抗性のグラム陽性菌さえも、この方法によって回収されました。
図 4. ナノポア、ショートリード、リードクラウド法により決定されたアルファ多様性と分類学的成分
旋盤は、生データの入力が 3 ～ 6 倍少ないにもかかわらず、ショートリードおよびリードクラウド アセンブリよりもはるかに長いアセンブリ全体 N50 を生成しました。ドラフトゲノムは、完全性、コンタミネーション、シングルコピーコア遺伝子などに基づいてドラフトが「高品質」または「部分的」に分類されるコンティグビニングによって生成されました。ロングリードアセンブリは、比較した場合と比較して、低コストではるかに高い連続性を示しました。ショートリードとリードクラウドへ。
図 5. 各メソッドの生物ごとのアセンブリの連続性
さらに、現在のアセンブリ手法は、閉じた環状ゲノムを生成することができます。便サンプルでは、8 つの高品質のシングルコンティグ ゲノムが組み立てられ、そのうち 5 つが正確な環状化を達成しました。ロングリードアプローチは、ゲノム内の反復要素を解決する際にも優れた能力を示しました。循環化コプリゲノムはこのアプローチによって生成されましたが、これには高度な配列反復が含まれることが知られています。ショートリードおよびリードクラウドによるこのゲノムの最良のアセンブリは、カバレッジ深度 4800X であっても、130 kb の N50 を超えることはありませんでした。これらの高コピー数要素は、ショートリードまたはリードクラウドアセンブリのブレークポイントでよく見られるロングリードアプローチによって完全に解決されました。この研究では、別の閉じたゲノムが報告されました。これは、最近報告されたゲノムのメンバーであると考えられていました。シビオバクタークレード。この閉じたアセンブリでは、8.5 ～ 65.9 kb の範囲の 5 つの推定ファージが同定されました。
図 6. P.copri および Cibiobacter sp のクローズドゲノムの Circos 図
参照
EL モス、DG マジニ、AS バット (2020)。ナノポアシークエンシングを使用したマイクロバイオームからの完全な閉じた細菌ゲノム。ネイチャーバイオテクノロジー、38(6)、701-707。
技術とハイライト は、実験計画やデータマイニングにおける素晴らしいアイデアだけでなく、さまざまな研究分野におけるさまざまなハイスループットシーケンス技術の最新の成功した応用を共有することを目的としています。
投稿時刻: 2022 年 1 月 7 日