METAGENOMI
Komplette, lukkede bakterielle genomer fra mikrobiomer ved bruk av nanopore-sekvensering
Nanopore-sekvensering |Metagenomikk |MAGs |Bakteriell genom sirkularisering |Tarmmikrobiota
Høydepunkter
1. En ny metode for å trekke ut lange fragmenter av DNA ble presentert i denne studien, som oppnådde ekstraksjon av mikrogram rent HMW DNA egnet for langlest sekvensering fra 300 mg avføring
2. En monteringsarbeidsflyt, Dreiebenk, ble introdusert i denne studien, der MAG-er ble satt sammen ved lange avlesninger og korrigert ved korte avlesninger.
3. Dreiebenk ble evaluert ved falsk blanding.7 av 12 bakterier ble vellykket satt sammen til enkeltkontiger og 3 ble satt sammen til fire eller færre kontiger.
4. Dreiebenk ble videre påført avføringsprøver, som genererte 20 sirkulariserte genomer, inkludert Prevotella copri og kandidat Cibiobacter sp., som var kjent for å være rike på mobile genetiske elementer.
Hovedprestasjon
Ekstraksjonsprotokoll for HWM DNA
Langleste sekvenseringsbaserte metagenomiske studier i tarmen har lenge vært plaget av hardhet ved utvinning av høymolekylært (HMW) DNA fra avføring.I denne studien ble en enzymbasert ekstraksjonsprotokoll introdusert for å unngå omfattende skjæring ved perleslag i tradisjonelle metoder.Som vist i følgende figur, ble prøvene først behandlet med en cocktail av enzymer, inkludert lytisk enzym, MetaPolyzyme, etc. for å bryte ned cellevegger.Frigitt DNA ble ekstrahert med fenol-kloroform-system, etterfulgt av proteinase K og RNase A fordøyelse, kolonnebasert rensing og SPRI-størrelsesvalg.Denne metoden klarte å gi mikrogram HMW DNA fra 300 m avføring, som oppfyller krav til langavlest sekvensering både når det gjelder kvalitet og kvantitet.
Figur 1. HWM DNA-ekstraksjonsskjema
Opplegg flyt av dreiebenk
Som beskrevet i følgende figur, inneholder Dreiebenk eksisterende prosess med rå basecalling-prosess ved bruk av Guppy.To langleste sammenstillinger produseres deretter av Flye og Canu separat etterfulgt av feilmontering deteksjon og fjerning.De to underenhetene slås sammen med quickmerge.Ved sammenslåing blir store sammenstillinger på megabasenivå deretter sjekket for sirkularisering.Deretter behandles konsensusavgrensning om disse forsamlingene med korte lesninger.De endelige sammensatte bakteriegenomene behandles for endelig påvisning og fjerning av feilmontering.
Figur 2. Skjemaflyt av dreiebenkenhet
Evaluering av dreiebenk med mock bakterieblanding
En standard ATCC 12-arter blanding bestående av både Gram-positive og Gram-negative bakterier ble brukt for å evaluere ytelsen til nanopore sekvenseringsplattform og dreiebenk i MAG-montering.Totalt 30,3 Gb data ble generert av nanopore-plattformen med N50 på 5,9 kb.Dreiebenk forbedret i stor grad sammenstillingen N50 til 1,6 til 4 ganger sammenlignet med andre langleste monteringsverktøy og 2 til 9 ganger sammenlignet med hybridmonteringsverktøy.Av 12 bakterielle genomer ble syv satt sammen til enkeltkontiger (Figur 3. Circos med svart prikk).Tre til ble satt sammen til fire eller færre contigs, der den mest ufullstendige sammenstillingen inneholdt 83% av genomet i en enkelt contig.
Figur 3. Genomsammenstillinger i en definert 12-arter bakterieblanding
Påføring av dreiebenk i avføringsprøver
Denne metoden ble videre brukt på menneskelige avføringsprøver for å sammenligne organismeidentifikasjon og monteringssammenheng med eksisterende metoder, lese-sky- og kortlest-basert analyse.Fra de tre involverte prøvene ga den nye enzymbaserte ekstraksjonen minst 1 μg per 300 mg tilført masse.Nanopore-sekvensering av disse HMW-DNA genererte langavlesninger med N50 på henholdsvis 4,7 kb, 3,0 kb og 3,0 kb.Spesielt viste dagens metode stort potensial i mikrobiell deteksjon sammenlignet med eksisterende metoder.Relativt høyere alfa-diversitet på artsnivå ble vist her sammenlignet med kortlest og lesesky.Dessuten ble alle slekter fra kortlest analyse, selv typisk lysis-resistente gram-positive organismer, gjenvunnet ved denne metoden.
Figur 4. Alfa-diversitet og taksanomiske komponenter bestemt av Nanopore, kortlest og lesesky-metoder
Dreiebenk ga mye lengre hele N50-enhet enn kortlest og lese-sky-montering, til tross for en tre- til seks ganger lavere inngang av rådata.Utkastgenomer ble produsert ved contig binning, der utkastene ble klassifisert i "høy kvalitet" eller "delvis" basert på fullstendighet, forurensning, enkeltkopi kjernegener osv. Langlest sammenstilling viste mye høyere sammenheng til lavere kostnad sammenlignet med å kortlese og lese-sky.
Figur 5. Sammenstilling per organisme for hver metode
Dessuten er dagens monteringstilnærming i stand til å gi lukkede, sirkulære genomer.I avføringsprøvene ble åtte enkelt-kontig genomer av høy kvalitet satt sammen, og fem av disse oppnådde nøyaktig sirkularisering.Langlest tilnærming viste også imponerende kapasitet til å løse repeterende elementer i genomer.SirkulærtP. coprigenomet ble generert av denne tilnærmingen, som har vært kjent for å inneholde høy grad av sekvensrepetisjon.Den beste sammenstillingen av dette genomet ved kortlesing og lesesky oversteg aldri N50 på 130 kb, selv med dekningsdybde på 4800X.Disse høye kopieringselementene ble fullstendig løst ved langlest-tilnærming, som ofte ble funnet ved bruddpunkter for kortlest- eller lese-sky-sammenstillinger.Et annet lukket genom ble rapportert i denne studien, som ble antatt å være medlem av nylig beskrevetCibiobakterclade.Fem antatte fager ble identifisert i denne lukkede sammenstillingen, varierende fra 8,5 til 65,9 kb.
Figur 6. Circosdiagram av lukkede genomer til P.copri og Cibiobacter sp.
Henvisning
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Komplette, lukkede bakterielle genomer fra mikrobiomer ved bruk av nanopore-sekvensering.Natur bioteknologi,38(6), 701-707.
Teknologi og høydepunkter tar sikte på å dele den siste vellykkede anvendelsen av forskjellige høykapasitets sekvenseringsteknologier på forskjellige forskningsarenaer, samt geniale ideer innen eksperimentell design og datautvinning.
Innleggstid: Jan-07-2022