МЕТАГЕНОМИК
Нанопорын дараалал ашиглан микробиомоос бүрэн, хаалттай бактерийн геном
Nanopore Sequencing |Метагеномик |MAGs |Бактерийн геномын эргэлт |Гэдэсний бичил биет
Онцлох үйл явдал
1. Энэхүү судалгаанд ДНХ-ийн урт хэсгүүдийг гаргаж авах шинэ аргыг танилцуулсан бөгөөд энэ нь 300 мг өтгөнөөс удаан уншихад тохиромжтой, цэвэр, HMW ДНХ-ийн микрограммыг гаргаж авсан.
2. Угсрах ажлын урсгал болох токарь энэ судалгаанд нэвтрүүлсэн бөгөөд MAG-уудыг урт унших замаар угсарч, богино унших замаар зассан.
3. Токарийг хуурамч хольцоор үнэлэв.12 нянгийн 7-г нь дан контиг, 3-ыг дөрөв ба түүнээс цөөн тоосонцор болгон угсарч чадсан.
4. Цаашид токарийг өтгөний дээж дээр хэрэглэсэн бөгөөд энэ нь Prevotella copri болон нэр дэвшигч Cibiobacter sp зэрэг 20 дугуй хэлбэртэй геном үүсгэсэн.хөдөлгөөнт генетикийн элементүүдээр баялаг гэдгээрээ алдартай байсан.
Гол ололт
HWM ДНХ-ийн хандлах протокол
Удаан уншсан дараалалд суурилсан гэдэсний метагеномын судалгаанууд нь өтгөнөөс өндөр молекул жинтэй (HMW) ДНХ гаргаж авахад хатуулагтай байсаар ирсэн.Энэхүү судалгаанд уламжлалт аргаар ирмэгийг цохих замаар их хэмжээний хяргахаас зайлсхийхийн тулд фермент дээр суурилсан хандлах протоколыг нэвтрүүлсэн.Дараах зурагт үзүүлсэнчлэн дээжийг эхлээд эсийн ханыг задлахын тулд литик фермент, МетаПолизим гэх мэт ферментийн коктейльоор эмчилсэн.Суллагдсан ДНХ-ийг фенол-хлороформын системээр гаргаж авсан ба дараа нь Протеиназа К ба RNase A-ийн задрал, баганад суурилсан цэвэршүүлэх, SPRI хэмжээг сонгох замаар гаргаж авсан.Энэ арга нь 300 м өтгөнөөс микрограмм HMW ДНХ гаргаж чадсан бөгөөд энэ нь чанар, тоо хэмжээний хувьд удаан уншсан дарааллын шаардлагыг хангасан.
Зураг 1. HWM ДНХ олборлох схем
Токарийн схемийн урсгал
Дараах зурагт тайлбарласны дагуу токарь нь Guppy ашиглан түүхий үндсэн дуудлагын процессыг агуулдаг.Удаан уншсан хоёр угсралтыг Flye болон Canu нар тус тусад нь үйлдвэрлэж, дараа нь угсралтын алдааг илрүүлж, арилгадаг.Хоёр дэд угсралт нь хурдан нийлүүлэлтээр нийлдэг.Нэгтгэсний дараа мегабаазын түвшний том чуулганыг тойрсон эсэхийг шалгана.Дараа нь эдгээр чуулгануудын талаархи зөвшилцлийн сайжруулалтыг богино унших замаар боловсруулдаг.Эцсийн угсарсан бактерийн геномыг эцсийн буруу угсралтыг илрүүлэх, арилгах зорилгоор боловсруулдаг.
Зураг 2. Токарийн угсралтын схемийн урсгал
Хуурамч бактерийн хольцтой токарийн үнэлгээ
Грам эерэг ба грам сөрөг бактерийг агуулсан стандарт ATCC 12 төрлийн хольцыг MAG угсралт дахь нанопорын дараалал тогтоох платформ болон токарийн гүйцэтгэлийг үнэлэхэд ашигласан.Нийт 30.3 Гб өгөгдлийг 5.9 кб-ийн N50 бүхий nanopore платформоор үүсгэсэн.Токарь нь N50 угсралтыг бусад удаан уншдаг угсрах хэрэгсэлтэй харьцуулахад 1.6-4 дахин, эрлийз угсрах хэрэгсэлтэй харьцуулахад 2-9 дахин сайжруулсан.Бактерийн 12 геномоос долоог нь нэг контиг болгон цуглуулсан (Зураг 3. Хар цэгтэй цирк).Өөр гурвыг дөрөв буюу түүнээс цөөн тооны контиг болгон нэгтгэсэн бөгөөд хамгийн бүрэн бус угсралт нь нэг контиг дахь геномын 83% -ийг агуулдаг.
Зураг 3. Тодорхойлогдсон 12 төрлийн бактерийн холимог дахь геномын нэгдэл
Өтгөний дээжинд токарь хэрэглэх
Организмыг тодорхойлох, угсралтын уялдаа холбоог одоо байгаа аргуудтай харьцуулах, унших-үүл, богино уншихад суурилсан шинжилгээ хийх зорилгоор энэ аргыг хүний өтгөний дээжинд хэрэглэсэн.Оруулсан гурван дээжээс фермент дээр суурилсан шинэ олборлолт нь 300 мг массаас дор хаяж 1 мкг гаргаж авсан.Эдгээр HMW ДНХ-ийн нано нүх сүв дараалал нь 4.7 кб, 3.0 кб болон 3.0 кб N50-тай урт хугацааны уншилтуудыг үүсгэсэн.Өнөөгийн арга нь одоо байгаа аргуудтай харьцуулахад бичил биетнийг илрүүлэхэд ихээхэн боломж байгааг харуулж байна.Богино уншигдах болон унших үүлтэй харьцуулахад харьцангуй өндөр зүйлийн түвшний альфа олон янз байдлыг энд харуулав.Түүнчлэн, богино хугацаанд уншсан шинжилгээнээс бүх төрлийн генийг, тэр ч байтугай ердийн лизис тэсвэртэй Грам эерэг организмуудыг энэ аргаар олж авсан.
Зураг 4. Nanopore, богино унших, унших үүлэн аргуудаар тодорхойлсон альфа олон янз байдал ба таксаномик бүрэлдэхүүн хэсгүүд
Токарь нь түүхий өгөгдөл 3-6 дахин бага оролттой байсан ч богино уншигдах ба уншдаг үүл угсралтаас хамаагүй урт N50 бүхэл угсралтыг бүтээжээ.Ноорог геномыг контиг биннинг аргаар гаргаж авсан бөгөөд нооргийг бүрэн бүтэн байдал, бохирдол, нэг хуулбар үндсэн ген гэх мэтээр нь "өндөр чанартай" эсвэл "хэсэгчилсэн" гэж ангилсан. богино унших болон унших-үүл.
Зураг 5. Арга тус бүрийн организм бүрийн угсралтын залгаа
Түүнээс гадна одоогийн угсралтын арга нь хаалттай, дугуй хэлбэртэй геном гаргах чадвартай.Өтгөний дээжинд өндөр чанартай, нэг төрлийн геномтой найман геномыг цуглуулсан бөгөөд эдгээрийн тав нь нарийн дугуй хэлбэртэй болсон.Удаан уншсан арга нь геном дахь давтагдах элементүүдийг шийдвэрлэх гайхалтай чадварыг харуулсан.ДугуйлсанP. copriЭнэ аргын тусламжтайгаар геномыг бий болгосон бөгөөд энэ нь дарааллын өндөр түвшний давталттай байдаг.Энэхүү геномын хамгийн сайн угсралт нь 4800X хамрах гүнтэй байсан ч 130 кб-ийн N50-аас хэтрээгүй.Хуулбарлах тоо ихтэй эдгээр элементүүдийг удаан унших арга барилаар бүрэн шийдсэн бөгөөд энэ нь ихэвчлэн богино уншигдах эсвэл уншдаг үүлэн чуулганы эвдрэлийн цэгүүдэд олддог.Энэхүү судалгаанд өөр нэг хаалттай геномыг мэдээлсэн бөгөөд энэ нь саяхан тайлбарласан гишүүн гэж тооцогддогЦибиобактерclade.Энэхүү хаалттай угсралтад 8.5-аас 65.9 кб хүртэлх таван таамагласан фаг тодорхойлсон.
Зураг 6. P.copri болон Cibiobacter sp-ийн хаалттай геномын циркийн диаграмм.
Лавлагаа
Мосс, Эл, Магини, Д.Ж., Бхатт, AS (2020).Нанопорын дараалал ашиглан микробиомоос бүрэн, хаалттай бактерийн геном.Байгалийн биотехнологи,38(6), 701-707.
Техник ба онцлох үйл явдал Судалгааны янз бүрийн талбарт өндөр бүтээмжтэй дэс дарааллын технологийн хамгийн сүүлийн үеийн амжилттай хэрэглэгдэхүүн, туршилтын дизайн, өгөгдөл олборлох гайхалтай санаануудыг хуваалцах зорилготой.
Шуудангийн цаг: 2022-01-07