METAGENOMIKA
Komplett, zárt bakteriális genomok mikrobiomokból nanopórusos szekvenálás segítségével
Nanopórus szekvenálás |Metagenomika |MAG-ok |Bakteriális genom cirkularizáció |A bél mikrobiota
Kiemelések
1. Ebben a tanulmányban egy új módszert mutattak be hosszú DNS-fragmensek kinyerésére, amellyel 300 mg székletből mikrogramm tiszta, hosszú leolvasású szekvenálásra alkalmas HMW DNS-t sikerült kivonni.
2. Ebben a tanulmányban egy összeszerelési munkafolyamatot, az Esztergat vezettek be, ahol a MAG-okat hosszú leolvasással állították össze, és rövid leolvasással javították ki.
3. Az esztergagépet álkeveréssel értékeltük.12 baktériumból 7 sikeresen egyetlen kontigba, 3 pedig négy vagy kevesebb kontigba állt össze.
4. A székletmintákon esztergagépet alkalmaztunk, amely 20 cirkuláris genomot hozott létre, beleértve a Prevotella copri-t és a jelölt Cibiobacter sp., amelyek mobil genetikai elemekben gazdagok voltak.
Fő eredmény
HWM DNS extrakciós protokollja
A régóta olvasott szekvenáláson alapuló bél metagenomikai vizsgálatokat régóta szenvedték a nagy molekulatömegű (HMW) DNS székletből történő extrakciójának keménysége miatt.Ebben a tanulmányban egy enzim alapú extrakciós protokollt vezettek be, hogy elkerüljék a hagyományos módszerekkel végzett gyöngyverés által okozott kiterjedt nyírást.Amint az a következő ábrán látható, a mintákat először enzimkoktéllal kezelték, beleértve a lítikus enzimet, a MetaPolyzyme-ot stb., hogy lebontsák a sejtfalakat.A felszabadult DNS-t fenol-kloroform rendszerrel extraháltuk, majd Proteináz K és RNáz A emésztést, oszlop alapú tisztítást és SPRI méretválasztást követett.Ezzel a módszerrel 300 m székletből mikrogramm HMW DNS-t sikerült előállítani, amely mind minőségi, mind mennyiségi szempontból megfelel a régóta leolvasott szekvenálási követelményeknek.
1. ábra: HWM DNS extrakciós séma
Eszterga sémafolyamata
A következő ábrán leírtak szerint az Eszterga a Guppy-t használó nyers alaphívási folyamat meglévő folyamatát tartalmazza.Ezután a Flye és a Canu külön-külön két régóta olvasott összeállítást állít elő, majd a hibás összeállítást észleli és eltávolítja.A két részegységet gyorsösszevonással egyesítik.Egyesítéskor a megabázis szintű nagy szerelvények körkörösségét ellenőrzik.Ezt követően ezekre az összeállításokra vonatkozó konszenzusos finomítást rövid leolvasásokkal dolgozzák fel.A véglegesen összeállított bakteriális genomokat feldolgozzák a végső összeszerelési hibák kimutatása és eltávolítása érdekében.
2. ábra: Esztergaszerelvény sémafolyamata
Eszterga értékelése álbaktérium keverékkel
A nanopórusos szekvenáló platform és az eszterga MAG összeállításban teljesítményének értékelésére egy standard ATCC 12 fajból álló keveréket használtak, amely Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokat is tartalmazott.Összesen 30,3 Gb adatot generált a nanopórus platform 5,9 kb N50-vel.Az eszterga nagymértékben javította az N50 összeszerelést, 1,6-4-szeresére a többi régóta olvasott összeszerelő szerszámhoz képest, és 2-9-szeresére a hibrid összeszerelő szerszámokhoz képest.A 12 bakteriális genomból hetet egyetlen kontigba állítottak össze (3. ábra: Cirók fekete ponttal).További hármat négy vagy kevesebb kontigba állítottak össze, amelyekben a legtökéletesebb összeállítás a genom 83%-át tartalmazta egyetlen kontigban.
3. ábra Genom összeállítások meghatározott 12 fajból álló baktériumkeverékben
Eszterga alkalmazása székletmintákban
Ezt a módszert humán székletmintákra is alkalmazták annak érdekében, hogy összehasonlítsák a szervezet azonosítását és összeállításának kontiguitását a meglévő módszerekkel, olvasás-felhővel és rövid leolvasáson alapuló elemzéssel.A három érintett mintából az új enzimalapú extrakció legalább 1 μg-ot adott 300 mg bemeneti tömegre.Ezeknek a HMW DNS-eknek a nanopórusos szekvenálása hosszú leolvasást eredményezett 4,7 kb, 3,0 kb és 3,0 kb N50-vel.Megjegyzendő, hogy a jelenlegi módszer nagy potenciált mutatott a mikrobiális kimutatásban a meglévő módszerekhez képest.Viszonylag magasabb fajszintű alfadiverzitást mutattak itt a rövid olvasási és olvasási felhőhöz képest.Ezen túlmenően ezzel a módszerrel a rövid leolvasású elemzésből származó összes nemzetséget, még a tipikusan lízisrezisztens Gram-pozitív organizmusokat is kinyertük.
4. ábra: Nanopore, short-read és read-cloud módszerekkel meghatározott alfadiverzitás és taxanómiai komponensek
Az esztergagép sokkal hosszabb teljes összeállítású N50-et eredményezett, mint a rövid leolvasású és az olvasási felhő összeállítása, annak ellenére, hogy három-hatszor alacsonyabb a nyers adatok bevitele.A genomvázlatokat kontig binning segítségével állítottuk elő, amelyben a piszkozatokat a teljesség, a szennyezettség, az egykópiás maggének stb. alapján „kiváló minőségű” vagy „részleges” kategóriába sorolták. rövid olvasáshoz és olvasási felhőhöz.
5. ábra. Az egyes módszerek szervezetenkénti összeállításának szomszédossága
Ezenkívül a jelenlegi összeállítási megközelítés zárt, körkörös genomokat eredményez.A székletmintákban nyolc kiváló minőségű, egy-kontig genomot állítottunk össze, és ezek közül öten sikerült percise cirkularizációt elérni.A régóta olvasott megközelítés lenyűgöző képességet mutatott a genomokban lévő ismétlődő elemek feloldásában is.KörbeírvaP. copriA genomot ezzel a megközelítéssel hozták létre, amelyről ismert, hogy nagyfokú szekvencia-ismétlődést tartalmaz.Ennek a genomnak a legjobb összeállítása rövid olvasási és olvasási felhő segítségével soha nem haladta meg a 130 kb-os N50-et, még 4800-szoros lefedettség mellett sem.Ezeket a nagy példányszámú elemeket teljesen feloldották a hosszú olvasási megközelítéssel, amely gyakran a rövid olvasási vagy olvasási felhő összeállítások töréspontjain található.Ebben a tanulmányban egy másik zárt genomról számoltak be, amelyről azt hitték, hogy a nemrégiben leírtak tagjaCibiobacterklád.Öt feltételezett fágot azonosítottak ebben a zárt összeállításban, 8,5 és 65,9 kb között.
6. ábra P.copri és Cibiobacter sp. zárt genomjainak cirkoszi diagramja.
Referencia
Moss, EL, Maghini, DG és Bhatt, AS (2020).Komplett, zárt bakteriális genomok mikrobiomokból nanopórusos szekvenálás segítségével.Természet biotechnológia,38(6), 701-707.
Technika és kiemelések célja a különböző nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiák legfrissebb sikeres alkalmazásainak megosztása a különböző kutatási színtereken, valamint a briliáns ötletek a kísérleti tervezés és adatbányászat terén.
Feladás időpontja: 2022-07-07