МЕТАГЕНОМІКА
Поўныя замкнёныя геномы бактэрый з мікрабіёмаў з выкарыстаннем секвенавання нанапор
Секвеніраванне нанапор |Метагеноміка |MAGs |Циркуляризация геному бактэрый |Мікрабіёта кішачніка
Асноўныя моманты
1. У гэтым даследаванні быў прадстаўлены новы метад экстракцыі доўгіх фрагментаў ДНК, які дасягнуў экстракцыі мікраграмаў чыстай ДНК HMW, прыдатнай для секвеніравання доўгага счытвання, з 300 мг калу.
2. У гэтым даследаванні быў прадстаўлены працоўны працэс зборкі Lathe, у якім MAG збіраліся шляхам доўгага чытання і карэкціраваліся шляхам кароткага чытання.
3. Такарны станок ацэньваўся па фіктыўнай сумесі.7 з 12 бактэрый былі паспяхова сабраны ў адзінкавыя кантыгі, а 3 былі сабраны ў чатыры ці менш кантыгаў.
4. Lathe быў ужыты да ўзораў кала, якія стварылі 20 кругавых геномаў, у тым ліку Prevotella copri і кандыдата Cibiobacter sp., якія былі вядомыя сваёй багатасцю мабільных генетычных элементаў.
Галоўнае дасягненне
Пратакол экстракцыі ДНК HWM
Метагеномныя даследаванні кішачніка, заснаваныя на секвеніраванні, даўно пакутуюць ад цяжкасцей пры вылучэнні ДНК з высокай малекулярнай масай (HMW) з крэсла.У гэтым даследаванні быў уведзены пратакол экстракцыі на аснове ферментаў, каб пазбегнуць інтэнсіўнага зруху шарыкам у традыцыйных метадах.Як паказана на наступным малюнку, узоры спачатку былі апрацаваны кактэйлем з ферментаў, у тым ліку літычнага фермента, MetaPolyzyme і г.д., каб разбурыць клеткавыя сценкі.Вызваленая ДНК была экстрагаваная сістэмай фенол-хлараформ з наступным расшчапленнем пратэіназай К і РНКазай А, ачысткай на аснове калонкі і выбарам памеру SPRI.Гэтым метадам удалося атрымаць мікраграмы ДНК HMW з 300 м2 крэсла, што адпавядае патрабаванням секвенирования як па якасці, так і па колькасці.
Малюнак 1. Схема экстракцыі ДНК HWM
Схема патоку такарнага станка
Як апісана на наступным малюнку, Lathe змяшчае існуючы працэс неапрацаванага працэсу базавага выкліку з выкарыстаннем Guppy.Затым Flye і Canu асобна ствараюць дзве даўно прачытаныя зборкі з наступным выяўленнем і выдаленнем няправільнай зборкі.Дзве зборкі аб'ядноўваюцца з дапамогай quickmerge.Пасля аб'яднання вялікія зборкі на ўзроўні мегабазы затым правяраюцца на кругазварот.Пасля ўдакладненне кансенсусу па гэтых зборках апрацоўваецца з дапамогай кароткіх чытанняў.Канчаткова сабраныя геномы бактэрый апрацоўваюцца для канчатковага выяўлення і выдалення няправільнай зборкі.
Малюнак 2. Схема зборкі такарнага станка
Ацэнка такарнага станка з фіктыўнай сумессю бактэрый
Стандартная сумесь 12 відаў ATCC, якая змяшчае як грамположительные, так і грамотріцательных бактэрыі, была выкарыстана для ацэнкі прадукцыйнасці платформы для секвенирования нанапор і Lathe ў зборцы MAG.У агульнай складанасці 30,3 Гб дадзеных было згенеравана платформай нанапор з N50 5,9 кб.Такарны станок у значнай ступені палепшыў зборку N50 у 1,6-4 разы ў параўнанні з іншымі даўно прачытанымі інструментамі для зборкі і ў 2-9 разоў у параўнанні з гібрыднымі інструментамі для зборкі.З 12 бактэрыяльных геномаў сем былі сабраны ў адзіныя кантыгі (Малюнак 3. Цырк з чорнай кропкай).Яшчэ тры былі сабраны ў чатыры або менш кантыгаў, у якіх самая няпоўная зборка ўтрымлівала 83% геному ў адным кантыгу.
Малюнак 3. Зборкі геному ў вызначанай сумесі бактэрый з 12 відаў
Прымяненне Lathe ў пробах кала
Гэты метад быў у далейшым ужыты да ўзораў кала чалавека, каб параўнаць ідэнтыфікацыю арганізма і сумежнасць зборкі з існуючымі метадамі, аналізам на аснове чытання з воблака і кароткага чытання.З трох задзейнічаных узораў новая экстракцыя на аснове ферментаў дала прынамсі 1 мкг на 300 мг уведзенай масы.Секвеніраванне нанапор гэтай HMW ДНК прывяло да доўгага чытання з N50 4,7 кб, 3,0 кб і 3,0 кб адпаведна.Варта адзначыць, што цяперашні метад паказаў вялікі патэнцыял у выяўленні мікробаў у параўнанні з існуючымі метадамі.Тут была паказана адносна большая альфа-разнастайнасць відавога ўзроўню ў параўнанні з кароткім чытаннем і воблачным чытаннем.Больш за тое, усе роды з аналізу кароткага чытання, нават звычайна ўстойлівыя да лізісу грамположительные арганізмы, былі адноўлены гэтым метадам.
Малюнак 4. Альфа-разнастайнасць і таксанамічныя кампаненты, вызначаныя метадамі Nanopore, кароткага чытання і воблачнага чытання
Lathe атрымаў значна больш працяглую зборку N50 у цэлым, чым зборка кароткага чытання і чытання ў воблаку, нягледзячы на ў тры-шэсць разоў меншы ўваход неапрацаваных даных.Чарнавікі геномаў ствараліся метадам кантыг-бінінга, у якім чарнавікі класіфікаваліся на «высакаякасныя» і «частковыя» на аснове паўнаты, забруджвання, адной копіі асноўных генаў і г. д. Даўночытаная зборка паказала значна больш высокую сумежнасць пры меншым кошце ў параўнанні для кароткага чытання і чытання ў воблаку.
Малюнак 5. Сумежнасць зборкі кожнага метаду па арганізме
Больш за тое, сучасны падыход зборкі здольны даць замкнёныя кругавыя геномы.Ва ўзорах кала было сабрана восем высакаякасных геномаў з адным кантыгам, і пяць з іх дасягнулі дакладнай цыркулярызацыі.Падыход доўгага чытання таксама паказаў уражальную здольнасць раздзяляць паўтаральныя элементы ў геномах.ЦыркулярызаваныP. copriгеном быў створаны з дапамогай гэтага падыходу, які, як вядома, змяшчае высокую ступень паўтарэння паслядоўнасці.Найлепшая зборка гэтага геному з дапамогай кароткага чытання і воблака чытання ніколі не перавышала N50 у 130 кб, нават пры глыбіні ахопу 4800X.Гэтыя элементы вялікай колькасці копій былі цалкам вырашаны падыходам доўгага чытання, які часта сустракаецца ў кропках разрыву зборак кароткага чытання або чытання ў воблаку.Яшчэ адзін закрыты геном быў зарэгістраваны ў гэтым даследаванні, які, як мяркуюць, быў членам нядаўна апісанагаЦибиобактерклада.У гэтай закрытай зборцы было ідэнтыфікавана пяць меркаваных фагаў памерам ад 8,5 да 65,9 кб.
Малюнак 6. Дыяграма Circos закрытых геномаў P.copri і Cibiobacter sp.
Даведка
Мос, Э.Л., Магіні, Д.Г., і Бхат, А.С. (2020).Поўныя замкнёныя геномы бактэрый з мікрабіёмаў з выкарыстаннем секвенавання нанапор.Біятэхналогія прыроды,38(6), 701-707.
Тэхналогія і асноўныя моманты імкнецца падзяліцца апошнім паспяховым прымяненнем розных высокапрадукцыйных тэхналогій секвеніравання ў розных даследчых сферах, а таксама бліскучымі ідэямі ў галіне распрацоўкі эксперыментаў і аналізу даных.
Час публікацыі: 7 студзеня 2022 г