МЕТАГЕНОМИКА
Нанопора секвенциясы арқылы микробиомалардан толық, жабық бактериялық геномдар
Nanopore Sequencing |Метагеномика |MAGs |Бактериялық геномның циркуляциялануы |Ішек микробиотасы
Маңызды жерлер
1. Бұл зерттеуде ДНҚ-ның ұзын фрагменттерін алудың жаңа әдісі ұсынылды, ол 300 мг нәжістен ұзақ оқуға жарамды HMW ДНҚ таза микрограммының экстракциясына қол жеткізді.
2. Бұл зерттеуде құрастыру жұмыс процесі, токарь, енгізілді, онда MAG ұзақ оқулар арқылы жиналды және қысқа оқулар арқылы түзетілді.
3. Токарлық станок жалған қоспамен бағаланды.12 бактерияның 7-і жалғыз контигтерге, ал 3-еуі төрт немесе одан да аз контигтерге біріктірілді.
4. Токарь одан әрі нәжіс үлгілеріне қолданылды, олар 20 айналмалы геномды, соның ішінде Prevotella copri және кандидат Cibiobacter sp., олар мобильді генетикалық элементтерге бай екені белгілі болды.
Негізгі жетістік
HWM ДНҚ үшін экстракция протоколы
Ұзақ оқылған секвенирлеуге негізделген ішектің метагеномдық зерттеулері нәжістен жоғары молекулалық салмақты (HMW) ДНҚ алу кезінде қаттылықтан ұзақ уақыт зардап шекті.Бұл зерттеуде дәстүрлі әдістерде моншақ ұру арқылы кең қырқуды болдырмау үшін ферментке негізделген экстракция протоколы енгізілді.Келесі суретте көрсетілгендей, үлгілер алдымен жасуша қабырғаларын ыдырату үшін литикалық ферментті, МетаПолизимді және т.б. қоса алғанда ферменттердің коктейльімен өңделген.Шығарылған ДНҚ фенол-хлороформ жүйесі арқылы экстракцияланды, содан кейін протеиназа K және RNase A қорыту, баған негізінде тазарту және SPRI өлшемін таңдау.Бұл әдіс 300 м нәжістен микрограмм HMW ДНҚ алуға мүмкіндік берді, ол сапа және сан жағынан ұзақ оқылатын секвенирлеу талаптарын орындайды.
Сурет 1. HWM ДНҚ экстракция схемасы
Токарлық станоктың схемалық ағыны
Төмендегі суретте сипатталғандай, токарь Guppy көмегімен өңделмеген негізгі шақыру процесінің бар процесін қамтиды.Ұзақ оқылған екі жинақты Flye және Canu бөлек шығарады, содан кейін қате құрастыруды анықтау және жою.Екі ішкі жинақ жылдам біріктіру арқылы біріктірілген.Біріктірілгеннен кейін мегабаза деңгейіндегі үлкен жинақтар айналмалы түрде тексеріледі.Кейіннен осы жинақтардағы консенсусты нақтылау қысқаша оқулармен өңделеді.Соңғы жиналған бактериялық геномдар түпкілікті қате құрастыруды анықтау және жою үшін өңделеді.
Сурет 2. Токарлық станогтың құрастыру ағынының схемасы
Жалған бактериялар қоспасы бар токарлық станокты бағалау
Грам-оң және грам-теріс бактериялардан тұратын стандартты ATCC 12-түрлі қоспасы MAG құрастыруындағы нанопораларды секвенирлеу платформасы мен токарлық станоктың өнімділігін бағалау үшін пайдаланылды.Жалпы көлемі 30,3 Гб деректер N50 5,9 кб болатын нанопора платформасында жасалды.Токарь N50 құрастыруын ұзақ оқылатын басқа құрастыру құралдарымен салыстырғанда 1,6-4 есе және гибридті құрастыру құралдарымен салыстырғанда 2-9 есе жақсартты.12 бактериялық геномның жетеуі бір контигтерге жиналды (3-сурет. Қара нүктелі циркоздар).Тағы үшеуі төрт немесе одан да аз контигтерге жиналды, олардағы ең толық емес жинақта бір контигтегі геномның 83% болды.
Сурет 3. Анықталған 12 түрді бактериялық қоспадағы геномдық жинақтар
Нәжіс үлгілерінде токарлық станокты қолдану
Бұл әдіс ағзаны сәйкестендіру мен жинақтауды бар әдістермен салыстыру, оқу-бұлт және қысқа оқу негізіндегі талдау үшін адамның нәжіс үлгілеріне қолданылды.Қатысқан үш үлгіден жаңа фермент негізіндегі экстракция 300 мг кіріс массасына кемінде 1 мкг берді.Осы HMW ДНҚ-ның нанопора секвенциясы N50 сәйкесінше 4,7 кб, 3,0 кб және 3,0 кб ұзақ оқулар жасады.Атап айтқанда, қазіргі әдіс микробтарды анықтауда қолданыстағы әдістермен салыстырғанда үлкен әлеуетті көрсетті.Мұнда қысқа оқылатын және оқылатын бұлтпен салыстырғанда салыстырмалы түрде жоғары түр деңгейіндегі альфа әртүрлілігі көрсетілген.Сонымен қатар, қысқа оқылатын талдаудан алынған барлық тектер, тіпті әдетте лизиске төзімді грам-позитивті организмдер де осы әдіс арқылы қалпына келтірілді.
Сурет 4. Nanopore, қысқа оқу және оқу-бұлттық әдістермен анықталған альфа әртүрлілігі және таксаникалық компоненттер
Токарлық станок қысқа оқылатын және оқылатын бұлтты жинаққа қарағанда N50 толық жинақты әлдеқайда ұзағырақ берді, шикі деректердің үш-алты есе аз енгізуіне қарамастан.Жобалық геномдар толықтығына, ластануына, бір көшірме өзек гендеріне және т.б. негізінде «жоғары сапалы» немесе «жартылай» болып жіктелетін контигпен байланыстыру арқылы жасалды. қысқа оқу және оқу бұлт.
5-сурет. Әрбір әдістің ағзаға сәйкес жинақталуы
Сонымен қатар, қазіргі құрастыру тәсілі жабық, айналмалы геномдарды беруге қабілетті.Нәжіс үлгілерінде сегіз жоғары сапалы, бір контигті геномдар жиналды және олардың бесеуі анық айналуға қол жеткізді.Ұзақ оқылатын тәсіл геномдардағы қайталанатын элементтерді шешуде әсерлі қабілетті көрсетті.АйналмалыP. copriгеном осы тәсіл арқылы жасалды, ол реттілік қайталанудың жоғары дәрежесін қамтитыны белгілі.Бұл геномның қысқа оқу және оқу бұлты арқылы ең жақсы жинағы ешқашан N50 130 кб-тан аспады, тіпті 4800X қамту тереңдігімен.Бұл көшірме санының жоғары элементтері ұзақ оқылатын тәсіл арқылы толығымен шешілді, олар жиі қысқа оқылатын немесе оқылатын бұлттық жинақтардың үзілу нүктелерінде табылды.Бұл зерттеуде жақында сипатталған мүшесі болып табылатын тағы бір жабық геном туралы хабарландыЦибиобактерклад.Бұл жабық жинақта 8,5-тен 65,9 кб-қа дейін болатын бес болжамды фаг анықталды.
Сурет 6. P.copri және Cibiobacter sp. жабық геномдарының циркос диаграммасы.
Анықтама
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Нанопора секвенциясы арқылы микробиомалардан толық, жабық бактериялық геномдар.Табиғат биотехнологиясы,38(6), 701-707.
Tech and Highlights әртүрлі зерттеулер аренасында әр түрлі жоғары өнімді секвенирлеу технологияларын ең соңғы сәтті қолдануды, сондай-ақ тәжірибелік дизайн мен деректерді өндірудегі тамаша идеялармен бөлісуді мақсат етеді.
Жіберу уақыты: 07 қаңтар 2022 ж