သတ္တုဗေဒ
နာနိုပရီစီစဉ်ကို အသုံးပြု၍ အဏုဇီဝများမှ ပြီးပြည့်စုံသော ပိတ်ထားသော ဘက်တီးရီးယား ဂျီနိုမ်များ
Nanopore Sequencing |Metagenomics |MAGs |ဘက်တီးရီးယား ဂျီနိုမ် လည်ပတ်မှု |အူ microbiota
ပေါ်လွင်သည်။
1. ရှည်လျားသော DNA အပိုင်းအစများကို ထုတ်ယူရန် ဆန်းသစ်သောနည်းလမ်းကို ဤလေ့လာမှုတွင် တင်ပြခဲ့ပြီး၊ စင်စစ် HMW DNA ကို 300 mg မှ ဖတ်ရှုရန် သင့်လျော်သော မိုက်ခရိုဂရမ်ကို ထုတ်ယူခြင်း အောင်မြင်ခဲ့သည်။
2. တပ်ဆင်ခြင်းလုပ်ငန်းအသွားအလာတစ်ခုဖြစ်သည့် Lathe ကို ဤလေ့လာမှုတွင် မိတ်ဆက်ခဲ့ပြီး MAG များကို ရှည်လျားစွာဖတ်ပြီး တိုတိုဖတ်ခြင်းဖြင့် ပြုပြင်ပေးပါသည်။
3.Lathe ကို mock mixure ဖြင့် အကဲဖြတ်ပါသည်။ဘက်တီးရီးယား 12 ခုအနက် 7 ခုကို contigs တစ်ခုတည်းအဖြစ်အောင်မြင်စွာစုဝေးခဲ့ပြီး 3 ခုကို လေးခု သို့မဟုတ် ပိုနည်းသော contigs အဖြစ်သို့စုဝေးခဲ့သည်။
4.Lathe ကို Prevotella copri နှင့် ကိုယ်စားလှယ် Cibiobacter sp အပါအဝင် ပတ်ချာလည်နေသော ဂျီနိုမ် 20 ကို ထုတ်လုပ်ပေးသော ဝမ်းနမူနာများတွင် ထပ်လောင်းအသုံးပြုထားပါသည်။မိုဘိုင်းမျိုးရိုးဗီဇဒြပ်စင်များကြွယ်ဝသောကြောင့်လူသိများသော၊
အဓိက အောင်မြင်မှု
HWM DNA အတွက် ထုတ်ယူခြင်း ပရိုတိုကော
ကြာရှည်စွာ ဖတ်ရှုထားသော စီတန်းခြင်းကို အခြေခံထားသော အူလမ်းကြောင်း ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ လေ့လာမှုများသည် မစင်မှ မြင့်မားသော မော်လီကျူးအလေးချိန် (HMW) DNA ကို ထုတ်ယူရာတွင် မာကျောမှုဒဏ်ကို ကြာရှည်စွာ ခံစားခဲ့ရသည်။ဤလေ့လာမှုတွင် သမားရိုးကျနည်းလမ်းများဖြင့် ပုတီးစေ့များရိုက်ခြင်းမှ ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ကွဲထွက်ခြင်းကို ရှောင်ရှားရန် အင်ဇိုင်းအခြေခံထုတ်ယူသည့် ပရိုတိုကောကို မိတ်ဆက်ခဲ့သည်။အောက်ဖော်ပြပါပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း နမူနာများကို lytic enzyme, MetaPolyzyme စသည်တို့အပါအဝင် အင်ဇိုင်းကော့တေးများဖြင့် ကုသပေးခဲ့ပါသည်။ထုတ်ပေးထားသော DNA ကို Phenol-chloroform စနစ်ဖြင့် ထုတ်ယူပြီး နောက်တွင် Proteinase K နှင့် RNase A အစာခြေခြင်း၊ ကော်လံအခြေခံသန့်စင်ခြင်း နှင့် SPRI အရွယ်အစား ရွေးချယ်မှုတို့ ဖြစ်သည်။ဤနည်းလမ်းသည် မစင် 300 မီတာမှ HMW DNA ၏ မိုက်ခရိုဂရမ်များကို ထုတ်လွှတ်နိုင်ခဲ့ပြီး အရည်အသွေးနှင့် အရေအတွက် နှစ်မျိုးလုံးတွင် ရှည်လျားသော စီတန်းခြင်းဆိုင်ရာ လိုအပ်ချက်များကို ဖြည့်ဆည်းပေးပါသည်။
ပုံ 1. HWM DNA ထုတ်ယူမှု အစီအစဉ်
Lathe ၏အစီအစဥ်စီးဆင်းမှု
အောက်ဖော်ပြပါပုံတွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း Lathe တွင် Guppy ကိုအသုံးပြု၍ ကုန်ကြမ်းအခြေခံခေါ်ဆိုခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်တွင် ရှိပြီးသားလုပ်ငန်းစဉ်ပါရှိသည်။ရှည်လျားသော စည်းဝေးပွဲနှစ်ခုကို Flye နှင့် Canu တို့က သီးခြားစီ ထုတ်လုပ်ပြီးနောက်တွင် မှားယွင်းစွာ တပ်ဆင်မှုအား သိရှိခြင်းနှင့် ဖယ်ရှားခြင်းတို့ဖြင့် သီးခြားစီ ထုတ်လုပ်သည်။အခွဲနှစ်ခုကို အမြန်ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသည်။ပေါင်းစည်းလိုက်သောအခါ၊ megabase အဆင့်ရှိ ကြီးမားသော စည်းဝေးပွဲများကို လှည့်ပတ်ခြင်းအတွက် စစ်ဆေးပါသည်။နောက်ပိုင်းတွင်၊ ဤစည်းဝေးပွဲများဆိုင်ရာ သဘောတူညီမှုကို တိုတိုစွတ်ဖတ်ခြင်းဖြင့် လုပ်ဆောင်ပါသည်။နောက်ဆုံး စုဝေးထားသော ဘက်တီးရီးယား ဂျီနိုမ်များကို နောက်ဆုံး စုဝေးမှု မှားယွင်းစွာ ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းနှင့် ဖယ်ရှားခြင်းအတွက် လုပ်ဆောင်သည်။
ပုံ 2. Lathe စည်းဝေးမှု၏အစီအစဉ်
ဘက်တီးရီးယားအရောအနှောကို လှောင်ပြောင်သော ဘက်တီးရီးယားဖြင့် ပေါင်းစက်ကို အကဲဖြတ်ခြင်း။
ဂရမ်-အပြုသဘောနှင့် ဂရမ်-အနုတ်လက္ခဏာဘက်တီးရီးယားများပါ၀င်သည့် စံ ATCC 12-မျိုးစိတ်အရောအနှောကို နာနိုပရီဆက်ခြင်းပလက်ဖောင်းနှင့် MAG စည်းဝေးပွဲတွင် Lathe ၏စွမ်းဆောင်ရည်ကိုအကဲဖြတ်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။စုစုပေါင်း 30.3 Gb ဒေတာကို N50 နှင့် 5.9 kb ရှိသော နာနိုပလပ်ဖောင်းမှ ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။Lathe သည် အခြား long-read assembly tools များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက တပ်ဆင်မှု N50 မှ 1.6 မှ 4 ဆအထိ ပိုမိုကောင်းမွန်လာပြီး hybridd assembly ကိရိယာများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက 2 မှ 9 ဆအထိ တိုးတက်ကောင်းမွန်လာပါသည်။ဘက်တီးရီးယားမျိုးရိုးဗီဇ ၁၂ မျိုးတွင်၊ ခုနစ်ခုကို တစ်ခုတည်းသော contigs အဖြစ်စုဝေးခဲ့သည် (ပုံ ၃။ အနက်ရောင်အစက်ရှိသော Circos)။နောက်ထပ် ၃ ခုကို contigs လေးခု သို့မဟုတ် အနည်းငယ်သာ စုစည်းထားပြီး၊ မပြည့်စုံဆုံး စုဝေးမှုတစ်ခုတွင် ဂျီနိုမ်၏ 83% ပါဝင်ပါသည်။
ပုံ 3။ သတ်မှတ်ထားသော 12 မျိုးစိတ် ဘက်တီးရီးယားအရောအနှောတွင် ဂျီနိုမ်စုပေါင်းများ
ဝမ်းနမူနာများတွင် Lathe ကိုအသုံးပြုခြင်း။
ဤနည်းလမ်းကို သက်ရှိများ၏ ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းနှင့် အစုအဝေး၏ ဆက်စပ်မှုကို လက်ရှိနည်းလမ်းများ၊ read-cloud နှင့် short-read based analysis တို့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ရန်အတွက် ဤနည်းလမ်းကို လူ့မစင်နမူနာများတွင် ထပ်မံအသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ပါ၀င်သောနမူနာသုံးခုမှ၊ အင်ဇိုင်းအခြေခံထုတ်ယူမှုအသစ်သည် input mass ၏ 300 mg လျှင် အနည်းဆုံး 1 μg ထုတ်ပေးသည်။ဤ HMW DNA ၏ နာနိုပရီ စီစစ်မှုသည် 4.7 kb၊ 3.0kb နှင့် 3.0kb အသီးသီးရှိသော N50 ဖြင့် ရှည်လျားသောဖတ်မှုများကို ထုတ်ပေးသည်။ထင်ရှားသည်မှာ လက်ရှိနည်းလမ်းသည် ရှိပြီးသားနည်းလမ်းများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အဏုဇီဝရှာဖွေခြင်းတွင် အလားအလာကောင်းများကို ပြသထားသည်။အတိုချုံးဖတ်ခြင်း နှင့် read-cloud တို့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဤနေရာတွင် မျိုးစိတ်အဆင့် အယ်လ်ဖာ ကွဲပြားမှု မြင့်မားသည်ကို ပြသထားသည်။ထို့အပြင်၊ ပုံမှန်အားဖြင့် lysis-ခံနိုင်ရည်ရှိသော Gram-positive သက်ရှိများပင်လျှင် တိုတောင်းသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမှ မျိုးရိုးအားလုံးကို ဤနည်းလမ်းဖြင့် ပြန်လည်တွေ့ရှိခဲ့သည်။
ပုံ 4။ Nanopore၊ တိုတောင်းသောဖတ်နည်းများနှင့် read-cloud နည်းလမ်းများဖြင့် ဆုံးဖြတ်ထားသော အယ်လ်ဖာ ကွဲပြားမှုနှင့် အခွန်ဆိုင်ရာ အစိတ်အပိုင်းများ
Lathe သည် ဒေတာကုန်ကြမ်းထည့်သွင်းမှု ၃ ဆမှ ခြောက်ဆ နည်းပါးသော်လည်း တိုတောင်းသောဖတ်ခြင်းနှင့် ဖတ်ရှုခြင်း cloud တပ်ဆင်ခြင်းထက် N50 သည် အစုအဝေးတစ်ခုလုံး ပိုရှည်စေသည်။မူကြမ်းများကို ပြည့်စုံမှု၊ ညစ်ညမ်းမှု၊ ကော်ပီတစ်ခုတည်းသော ပင်မဗီဇ စသည်တို့အပေါ် အခြေခံ၍ မူကြမ်းများကို "အရည်အသွေးမြင့်" သို့မဟုတ် "တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း" ဟူ၍ ခွဲခြားသတ်မှတ်ထားသည့် မူကြမ်းများကို contig binning ဖြင့် ထုတ်လုပ်ထားပါသည်။ ရှည်လျားစွာဖတ်ထားသော စုဝေးမှုသည် နှိုင်းယှဉ်ပါက ကုန်ကျစရိတ်သက်သာပါသည်။ short-read နှင့် read-cloud သို့။
ပုံ 5. Per-organism assembly တစ်ခုချင်းစီ၏ contiguity
ထို့အပြင်၊ ပစ္စုပ္ပန်စုဝေးမှုချဉ်းကပ်မှုသည် အပိတ်၊ စက်ဝိုင်းဂျီနိုမ်များကို ထုတ်ပေးနိုင်စွမ်းရှိသည်။မစင်နမူနာများတွင် အရည်အသွေးမြင့်သော တစ်ခုတည်းသော ဂျီနိုမ်ရှစ်မျိုး စုဝေးပြီး ယင်းတို့အနက် ငါးခုသည် percise circularization ကို ရရှိခဲ့သည်။ရှည်လျားသော ချဉ်းကပ်နည်းသည် ဂျီနိုမ်ရှိ ထပ်တလဲလဲ ဒြပ်စင်များကို ဖြေရှင်းရာတွင် အထင်ကြီးလောက်သော စွမ်းရည်ကိုလည်း ပြသခဲ့သည်။ပတ်ချာလည်P. copriအစီအစဥ် ထပ်တလဲလဲ ဒီဂရီ မြင့်မားစွာ ပါဝင်ကြောင်း သိရှိထားသည့် ဤချဉ်းကပ်နည်းဖြင့် ဂျီနိုမ်ကို ထုတ်ပေးပါသည်။short-read and read-cloud ဖြင့် ဤဂျီနိုမ်၏ အကောင်းဆုံး စုဝေးမှုသည် 130 kb ၏ N50 ကို ဘယ်သောအခါမှ မကျော်လွန်ဘဲ လွှမ်းခြုံမှု အတိမ်အနက် 4800X ရှိသည်။တိုတောင်းသောဖတ်ခြင်း သို့မဟုတ် read-cloud စည်းဝေးပွဲများ၏ ကွဲလွဲသည့်အချက်များတွင် တွေ့ရလေ့ရှိသော ဤမြင့်မားသောမိတ္တူနံပါတ်ဒြပ်စင်များကို ရှည်လျားသောအဖတ်နည်းလမ်းဖြင့် အပြည့်အဝဖြေရှင်းထားပါသည်။မကြာသေးမီက ဖော်ပြခဲ့သော အဖွဲ့ဝင်တစ်ဦးဟု ယူဆရသည့် အခြားသော ပိတ်ထားသော ဂျီနိုမ်ကို ဤလေ့လာမှုတွင် အစီရင်ခံခဲ့သည်။Cibiobacterclade8.5 မှ 65.9 kb အထိရှိသော ဤပိတ်စုဝေးမှုတွင် putative phage ငါးခုကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။
ပုံ 6. P.copri နှင့် Cibiobacter sp ၏ ပိတ်ထားသော မျိုးဗီဇများ၏ Circos diagram
အကိုးအကား
Moss၊ EL၊ Maghini၊ DG၊ & Bhatt၊ AS (2020)။နာနိုပရီစီစဉ်ကို အသုံးပြု၍ အဏုဇီဝများမှ ပြီးပြည့်စုံသော ပိတ်ထားသော ဘက်တီးရီးယား ဂျီနိုမ်များ။သဘာဝဇီဝနည်းပညာ၊38(၆) ၇၀၁-၇၀၇။
နည်းပညာနှင့် ပေါ်လွင်ချက်များ သုတေသနနယ်ပယ်အသီးသီးရှိ မတူညီသောအဆင့်မြင့်ဆင့်ကဲနည်းပညာများကို မကြာသေးမီက အောင်မြင်သောအသုံးချပလီကေးရှင်းများကို မျှဝေရန်နှင့် စမ်းသပ်ဒီဇိုင်းရေးဆွဲခြင်းနှင့် ဒေတာတူးဖော်ခြင်းတွင် တောက်ပသောစိတ်ကူးစိတ်သန်းများကို မျှဝေရန် ရည်ရွယ်ပါသည်။
စာတိုက်အချိန်- Jan-07-2022