METAGENOMIA
Täydelliset, suljetut bakteerigenomit mikrobiomeista nanohuokosekvensointia käyttäen
Nanopore-sekvensointi |Metagenomiikka |MAG:t |Bakteerigenomin kiertokulku |Suoliston mikrobiota
Kohokohdat
1. Tässä tutkimuksessa esiteltiin uusi menetelmä pitkien DNA-fragmenttien uuttamiseksi, jolla saatiin aikaan mikrogramman puhdasta HMW-DNA:ta, joka soveltui pitkään luettavaan sekvensointiin, uuttaminen 300 mg:sta ulosteesta
2. Tässä tutkimuksessa otettiin käyttöön kokoonpanotyönkulku, Lathe, jossa MAG:t koottiin pitkillä lukemilla ja korjattiin lyhyillä lukukerroilla.
3. Sorvi arvioitiin valesekoituksella.7 bakteerista 12:sta koottiin onnistuneesti yksittäisiksi jatkumoiksi ja 3 koottiin neljäksi tai pienemmäksi jatkumoksi.
4. Sorvia levitettiin edelleen ulostenäytteille, jotka tuottivat 20 sirkulaarista genomia, mukaan lukien Prevotella copri ja ehdokas Cibiobacter sp., joiden tiedettiin olevan runsaasti liikkuvia geneettisiä elementtejä.
Pääsaavutus
HWM DNA:n uuttoprotokolla
Pitkään luetut sekvensointiin perustuvat suoliston metagenomiset tutkimukset ovat pitkään kärsineet kovuudesta erottaa korkean molekyylipainon (HMW) DNA:ta ulosteesta.Tässä tutkimuksessa otettiin käyttöön entsyymipohjainen uuttoprotokolla, jotta vältytään perinteisillä menetelmillä tapahtuvan helmien hakkaamisen aiheuttaman laajan leikkauksen välttämiseksi.Kuten seuraavassa kuvassa esitetään, näytteet käsiteltiin ensin entsyymien sekoituksella, mukaan lukien lyyttinen entsyymi, MetaPolyzyme jne. soluseinien hajottamiseksi.Vapautunut DNA uutettiin fenoli-kloroformisysteemillä, mitä seurasi Proteinaasi K- ja RNaasi A -digestio, pylväspohjainen puhdistus ja SPRI-koon valinta.Tällä menetelmällä saatiin mikrogrammaa HMW-DNA:ta 300 metrin päästä ulosteesta, joka täyttää pitkään luetut sekvensointivaatimukset sekä laadun että määrän suhteen.
Kuva 1. HWM DNA:n uuttokaavio
Sorvin kaaviovirta
Kuten seuraavassa kuvassa on kuvattu, Lathe sisältää olemassa olevan raakaperussoittoprosessin, jossa käytetään Guppya.Flye ja Canu tuottavat sitten kaksi pitkään luettua kokoonpanoa erikseen, mitä seuraa kokoonpanovirheiden havaitseminen ja poistaminen.Nämä kaksi osakokoonpanoa yhdistetään pikaliitännällä.Yhdistettäessä suuret kokoonpanot megakantatasolla tarkistetaan kiertokulkuisuuden varalta.Myöhemmin näiden kokoonpanojen konsensustarkistus käsitellään lyhyillä lukemilla.Lopullisesti kootut bakteerigenomit käsitellään lopullisen virheellisen kokoonpanon havaitsemiseksi ja poistamiseksi.
Kuva 2. Sorvikokoonpanon kaaviokulku
Sorvin arviointi valebakteeriseoksella
ATCC 12 -lajin standardiseosta, joka sisälsi sekä grampositiivisia että gramnegatiivisia bakteereja, käytettiin arvioimaan nanohuokosekvensointialustan ja sorvin suorituskykyä MAG-kokoonpanossa.Yhteensä 30,3 Gb dataa tuotettiin nanopore-alustalla, jonka N50 oli 5,9 kb.Sorvi paransi kokoonpanoa N50 huomattavasti 1,6-4-kertaisesti verrattuna muihin pitkään lueteltuihin kokoonpanotyökaluihin ja 2-9-kertaisesti hybridikokoonpanotyökaluihin verrattuna.12 bakteerigenomista seitsemän koottiin yksittäisiksi jatkumoiksi (Kuva 3. Sirkot mustalla pisteellä).Kolme muuta koottiin neljään tai harvempaan jatkumoon, joissa epätäydellisin kokoonpano sisälsi 83 % genomista yhdessä jatkumossa.
Kuva 3. Genomikokoonpanot määritellyssä 12 lajin bakteeriseoksessa
Sorvin käyttö ulostenäytteissä
Tätä menetelmää sovellettiin edelleen ihmisen ulostenäytteisiin organismin tunnistamisen ja kokoonpanon vierekkäisyyden vertaamiseksi olemassa oleviin menetelmiin, lukupilvi- ja lyhytlukupohjaiseen analyysiin.Kolmesta mukana olevasta näytteestä uusi entsyymipohjainen uutto tuotti vähintään 1 μg 300 mg:aa syöttömassaa kohti.Näiden HMW-DNA:n nanohuokosekvensointi tuotti pitkiä lukuja N50:llä 4,7 kb, 3,0 kb ja 3,0 kb.Erityisesti nykyinen menetelmä osoitti suurta potentiaalia mikrobien havaitsemisessa verrattuna olemassa oleviin menetelmiin.Tässä osoitettiin suhteellisen korkeampi lajitason alfadiversiteetti verrattuna lyhytluku- ja lukupilveen.Lisäksi kaikki suvut lyhytlukuanalyysistä, jopa tyypillisesti hajoamisresistentit grampositiiviset organismit, otettiin talteen tällä menetelmällä.
Kuva 4. Nanoporen avulla määritetty alfadiversiteetti ja taksonominen komponentit, lyhytluku- ja lukupilvimenetelmät
Sorvi tuotti paljon pidemmän koko-kokoonpanon N50:n kuin lyhytluku- ja lukupilvikokoonpano, vaikka raakadatan syöttö oli kolmesta kuuteen kertaa pienempi.Genomiluonnokset tuotettiin contig binning -menetelmällä, jossa luonnokset luokiteltiin "korkealaatuisiksi" tai "osittaisiksi" täydellisyyden, kontaminaation, yhden kopion ydingeenien jne. perusteella. Pitkään luettu kokoonpano osoitti paljon suuremman vierekkäisyyden pienemmillä kustannuksilla verrattuna. lyhyeen lukemiseen ja lukupilveen.
Kuva 5. Kunkin menetelmän organismikohtainen kokoonpano
Lisäksi nykyinen kokoonpanomenetelmä pystyy tuottamaan suljettuja, pyöreitä genomeja.Ulostenäytteissä koottiin kahdeksan korkealaatuista yhden jatkumon genomia, joista viisi saavutti perse-kiertokirjeen.Pitkään luettu lähestymistapa osoitti myös vaikuttavaa kapasiteettia genomien toistuvien elementtien ratkaisemisessa.PyöritettyP. coprigenomi luotiin tällä lähestymistavalla, jonka tiedetään sisältävän runsaasti sekvenssien toistoa.Tämän genomin paras kokoonpano lyhyen luku- ja lukupilven avulla ei koskaan ylittänyt 130 kb:n N50-arvoa edes 4800-kertaisen peittosyvyyden kanssa.Nämä suuren kopiomäärän elementit ratkaistiin täysin pitkän lukumenetelmän avulla, joka usein löydettiin lyhyen luku- tai lukupilvikokoonpanojen murtumispisteistä.Tässä tutkimuksessa raportoitiin toinen suljettu genomi, jonka uskottiin kuuluvan äskettäin kuvattuunCibiobacterclade.Tässä suljetussa kokoonpanossa tunnistettiin viisi oletettua faagia, jotka vaihtelivat välillä 8,5 - 65,9 kb.
Kuva 6. Circos-kaavio P.coprin ja Cibiobacter sp.:n suljetuista genomeista.
Viite
Moss, EL, Maghini, DG ja Bhatt, AS (2020).Täydelliset, suljetut bakteerigenomit mikrobiomeista nanohuokosekvensointia käyttäen.Luonnon biotekniikka,38(6), 701-707.
Tekniikka ja kohokohdat Tavoitteena on jakaa erilaisten korkean suorituskyvyn sekvensointiteknologioiden viimeisimpiä onnistuneita sovelluksia eri tutkimusareenoilla sekä loistavia ideoita kokeelliseen suunnitteluun ja tiedon louhintaan.
Postitusaika: 07.01.2022