METAGENOMIKA
Mikrobiomalardan to'liq, yopiq bakterial genomlar nanopore sekvensiyasi yordamida
Nanoporlarni tartiblash |Metagenomika |MAGs |Bakterial genomning sirkulyarizatsiyasi |Ichak mikrobiotasi
Eng muhimlar
1. Ushbu tadqiqotda 300 mg najasdan uzoq vaqt davomida o'qish uchun mos bo'lgan sof, HMW DNK mikrogramini ajratib olish imkonini beruvchi DNKning uzun bo'laklarini ajratib olishning yangi usuli taqdim etildi.
2.Ushbu tadqiqotda yig'ish ish jarayoni, Torna joriy etildi, unda MAGlar uzoq o'qishlar bilan yig'ildi va qisqa o'qishlar bilan tuzatildi.
3.Tokarlik soxta aralashma bilan baholandi.12 bakteriyadan 7 tasi muvaffaqiyatli bitta kontigga, 3 tasi esa to'rt yoki undan kam kontigga yig'ildi.
4. Torna keyinchalik axlat namunalariga qo'llanildi, ular 20 ta sirkulyar genomlarni, jumladan Prevotella copri va nomzod Cibiobacter sp., ular mobil genetik elementlarga boyligi bilan mashhur edi.
Asosiy yutuq
HWM DNK uchun ekstraksiya protokoli
Uzoq vaqt davomida o'qilgan ketma-ketlikka asoslangan ichak metagenomik tadqiqotlari axlatdan yuqori molekulyar og'irlikdagi (HMW) DNKni ajratib olishda qattiqlikdan uzoq vaqt davomida azoblangan.Ushbu tadqiqotda an'anaviy usullarda boncuk urish orqali keng qirqishning oldini olish uchun fermentga asoslangan ekstraksiya protokoli joriy etildi.Quyidagi rasmda ko'rsatilganidek, namunalar birinchi navbatda hujayra devorlarini buzish uchun fermentlar kokteyli, jumladan litik ferment, MetaPolyzyme va boshqalar bilan ishlov berilgan.Chiqarilgan DNK Fenol-xloroform tizimi, so'ngra Proteinaz K va RNase A hazm qilish, ustunga asoslangan tozalash va SPRI o'lchamini tanlash orqali ekstraksiya qilindi.Ushbu usul 300 m axlatdan mikrogramlar HMW DNK olishga muvaffaq bo'ldi, bu sifat va miqdor jihatidan uzoq vaqt davomida o'qiladigan ketma-ketlik talablariga javob beradi.
Shakl 1. HWM DNK ekstraktsiya sxemasi
Torna stanogining sxemasi
Quyidagi rasmda ta'riflanganidek, Torna Guppy yordamida xom-ashyoni chaqirish jarayonining mavjud jarayonini o'z ichiga oladi.Keyinchalik Flye va Canu tomonidan uzoq vaqt o'qilgan ikkita yig'ilish alohida ishlab chiqariladi, so'ngra noto'g'ri yig'ilishni aniqlash va olib tashlash.Ikki kichik yig'ilish tezkor birlashtirish bilan birlashtirilgan.Birlashtirilgandan so'ng, megabaza darajasidagi katta yig'ilishlar aylanma uchun tekshiriladi.Keyinchalik, ushbu yig'ilishlar bo'yicha konsensus takomillashtirish qisqa o'qishlar bilan qayta ishlanadi.Yakuniy yig'ilgan bakterial genomlar yakuniy noto'g'ri yig'ilishni aniqlash va olib tashlash uchun qayta ishlanadi.
Shakl 2. Torna stanogi yig'ilishining sxema oqimi
Torna stanogini soxta bakteriyalar aralashmasi bilan baholash
Gram-musbat va gramm-manfiy bakteriyalarni o'z ichiga olgan standart ATCC 12-turli aralashmasi MAG yig'ilishida nanoporlarni sekvensiyalash platformasi va torna ish faoliyatini baholash uchun ishlatilgan.Jami 30,3 Gb ma'lumot nanopore platformasi tomonidan 5,9 kb N50 bilan yaratilgan.Torna N50 yig'ish moslamasini boshqa uzoq o'qiladigan yig'ish asboblari bilan solishtirganda 1,6 dan 4 baravargacha va gibrid yig'ish asboblariga nisbatan 2 dan 9 martagacha yaxshilagan.12 ta bakterial genomdan yettitasi bitta kontigga yig'ilgan (3-rasm. Qora nuqtali sirklar).Yana uchtasi to'rt yoki undan kam kontigga yig'ildi, ulardagi eng to'liq bo'lmagan birikma bitta kontigda genomning 83% ni o'z ichiga oladi.
Shakl 3. Aniqlangan 12 turdagi bakterial aralashmadagi genom birikmalari
Torna stanogini axlat namunalarida qo'llash
Ushbu usul organizmni identifikatsiyalash va yig'ilishning yaqinligini mavjud usullar bilan solishtirish, o'qish-bulut va qisqa o'qishga asoslangan tahlil qilish uchun inson axlat namunalariga qo'llanildi.Ishtirok etilgan uchta namunadan fermentga asoslangan yangi ekstraktsiya 300 mg kirish massasiga kamida 1 mkg hosil qildi.Ushbu HMW DNKning nanoporda ketma-ketligi N50 mos ravishda 4,7 kb, 3,0 kb va 3,0 kb bilan uzoq muddatli o'qishlarni hosil qildi.Shunisi e'tiborga loyiqki, hozirgi usul mavjud usullarga nisbatan mikroblarni aniqlashda katta imkoniyatlarni ko'rsatdi.Bu erda qisqa o'qiladigan va o'qiladigan bulutga nisbatan nisbatan yuqori tur darajasidagi alfa xilma-xilligi ko'rsatilgan.Bundan tashqari, qisqa muddatli tahlildan olingan barcha avlodlar, hatto odatda lizizga chidamli Gram-musbat organizmlar ham ushbu usul bilan tiklandi.
Shakl 4. Nanopore, qisqa o'qish va o'qish-bulut usullari bilan aniqlangan alfa xilma-xilligi va taksanomik komponentlar
Tokarlik stanogi qisqa oʻqiladigan va oʻqiladigan bulutli yigʻilishga qaraganda ancha uzoqroq N50 yigʻilishini berdi, ammo xom maʼlumotlarning uch-olti baravar kam kiritilishiga qaramay.Qoralama genomlar kontig binning orqali ishlab chiqarilgan, unda qoralamalar toʻliqligi, ifloslanishi, bir nusxali yadro genlari va boshqalar asosida “yuqori sifatli” yoki “qisman” ga boʻlingan. qisqa o'qish va bulutli o'qish.
Shakl 5. Har bir usulning organizmga to'g'ri kelishi
Bundan tashqari, hozirgi yig'ish yondashuvi yopiq, aylana genomlarini berishga qodir.Najas namunalarida sakkizta yuqori sifatli, bir-biriga bog'liq genomlar yig'ildi va ulardan beshtasi aniq aylanaga erishdi.Uzoq o'qilgan yondashuv, shuningdek, genomlardagi takrorlanuvchi elementlarni hal qilishda ta'sirchan qobiliyatni ko'rsatdi.DoiraviyP. coprigenom yuqori darajadagi ketma-ketlik takrorlanishini o'z ichiga olgan ma'lum bo'lgan ushbu yondashuv bilan yaratilgan.Qisqa o'qish va o'qish-bulut orqali ushbu genomning eng yaxshi yig'ilishi hech qachon N50 dan 130 kb dan oshmaydi, hatto qamrov chuqurligi 4800X bo'lsa ham.Ushbu yuqori nusxa soni elementlari uzoq o'qish yondashuvi bilan to'liq hal qilindi, ular ko'pincha qisqa o'qiladigan yoki o'qiladigan bulutli yig'ilishlarning uzilish nuqtalarida topiladi.Ushbu tadqiqotda yaqinda tasvirlangan a'zo bo'lgan yana bir yopiq genom haqida xabar berilganCibiobacterqiyofa.Ushbu yopiq yig'ilishda 8,5 dan 65,9 kb gacha bo'lgan beshta taxminiy fag aniqlandi.
Shakl 6. P.copri va Cibiobacter sp yopiq genomlarining sirkos diagrammasi.
Malumot
Moss, EL, Maghini, DG va Bhatt, AS (2020).Mikrobiomalardan to'liq, yopiq bakterial genomlar nanopore sekvensiyasi yordamida.Tabiat biotexnologiyasi,38(6), 701-707.
Texnika va diqqatga sazovor joylar Turli tadqiqot sohalarida yuqori mahsuldorlikka ega ketma-ketlik texnologiyalarini eng so'nggi muvaffaqiyatli qo'llash, shuningdek, eksperimental dizayn va ma'lumotlarni qazib olish bo'yicha ajoyib g'oyalarni baham ko'rishga qaratilgan.
Xabar vaqti: 07-07-2022 yil