મેટાજેનોમિક્સ
નેનોપોર સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ કરીને માઇક્રોબાયોમ્સમાંથી સંપૂર્ણ, બંધ બેક્ટેરિયલ જીનોમ
નેનોપોર સિક્વન્સિંગ |મેટાજેનોમિક્સ |MAGs |બેક્ટેરિયલ જીનોમ પરિપત્ર |ગટ માઇક્રોબાયોટા
હાઇલાઇટ્સ
1. આ અભ્યાસમાં ડીએનએના લાંબા ટુકડાઓ કાઢવાની એક નવીન પદ્ધતિ રજૂ કરવામાં આવી હતી, જેણે 300 મિલિગ્રામ સ્ટૂલમાંથી લાંબા સમય સુધી વાંચવા માટે યોગ્ય એચએમડબલ્યુ ડીએનએના માઇક્રોગ્રામનું નિષ્કર્ષણ પ્રાપ્ત કર્યું હતું.
2. એક એસેમ્બલી વર્કફ્લો, લેથ, આ અભ્યાસમાં રજૂ કરવામાં આવ્યું હતું, જ્યાં MAGsને લાંબા વાંચન દ્વારા એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા અને ટૂંકા વાંચન દ્વારા સુધારવામાં આવ્યા હતા.
3.મોક મિશ્રણ દ્વારા લેથનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.12 માંથી 7 બેક્ટેરિયા સફળતાપૂર્વક સિંગલ કોન્ટિગ્સમાં એસેમ્બલ થયા હતા અને 3 ચાર કે તેથી ઓછા કોન્ટિગ્સમાં એસેમ્બલ થયા હતા.
4. સ્ટૂલ સેમ્પલ પર લેથ વધુ લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું, જેણે પ્રીવોટેલા કોપ્રી અને ઉમેદવાર સિબીઓબેક્ટર એસપી સહિત 20 ગોળાકાર જીનોમ બનાવ્યા હતા., જે મોબાઇલ આનુવંશિક તત્વોથી સમૃદ્ધ હોવા માટે જાણીતા હતા.
મુખ્ય સિદ્ધિ
HWM DNA માટે નિષ્કર્ષણ પ્રોટોકોલ
લાંબા સમયથી વાંચેલા સિક્વન્સિંગ આધારિત ગટ મેટાજેનોમિક અભ્યાસો લાંબા સમયથી સ્ટૂલમાંથી ઉચ્ચ પરમાણુ વજન (HMW) DNA કાઢવામાં કઠિનતાથી પીડાય છે.આ અભ્યાસમાં, પરંપરાગત પદ્ધતિઓમાં મણકો મારવાથી વ્યાપક શીયરિંગને ટાળવા માટે એન્ઝાઇમ-આધારિત નિષ્કર્ષણ પ્રોટોકોલ રજૂ કરવામાં આવ્યો હતો.નીચેની આકૃતિમાં બતાવ્યા પ્રમાણે, સેલની દિવાલોને ડિગ્રેજ કરવા માટે સૌપ્રથમ સેમ્પલને એન્ઝાઇમના કોકટેલ સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી, જેમાં લિટીક એન્ઝાઇમ, મેટાપોલીઝાઇમ વગેરેનો સમાવેશ થાય છે.રીલીઝ થયેલ ડીએનએ ફેનોલ-ક્લોરોફોર્મ સિસ્ટમ દ્વારા કાઢવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ પ્રોટીનનેઝ K અને RNase A પાચન, કોલમ આધારિત શુદ્ધિકરણ અને SPRI કદની પસંદગી.આ પદ્ધતિ 300 મીટર સ્ટૂલમાંથી HMW DNA ના માઇક્રોગ્રામ મેળવવામાં વ્યવસ્થાપિત છે, જે ગુણવત્તા અને જથ્થા બંનેના સંદર્ભમાં લાંબા સમય સુધી વાંચવા માટેની સિક્વન્સિંગ આવશ્યકતાઓને પૂર્ણ કરે છે.
આકૃતિ 1. HWM DNA નિષ્કર્ષણ યોજના
લેથની યોજનાનો પ્રવાહ
નીચેની આકૃતિમાં વર્ણવ્યા મુજબ, લેથમાં ગપ્પીનો ઉપયોગ કરીને કાચી બેઝકોલિંગ પ્રક્રિયાની હાલની પ્રક્રિયા છે.ત્યારપછી ફ્લાય અને કેનુ દ્વારા બે લાંબા સમયથી વાંચેલી એસેમ્બલીઓનું ઉત્પાદન કરવામાં આવે છે અને ત્યારબાદ ખોટી એસેમ્બલી શોધ અને દૂર કરવામાં આવે છે.બે પેટા એસેમ્બલી ક્વિક મર્જ સાથે મર્જ કરવામાં આવી છે.મર્જ કર્યા પછી, મેગાબેઝ સ્તરે મોટી એસેમ્બલીઓ પછી પરિપત્ર માટે તપાસવામાં આવે છે.ત્યારબાદ, આ એસેમ્બલીઓ પર સર્વસંમતિ શુદ્ધિકરણ ટૂંકા વાંચન સાથે પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે.ફાઇનલ એસેમ્બલ બેક્ટેરિયલ જીનોમ પર અંતિમ ખોટી એસેમ્બલી શોધ અને દૂર કરવા માટે પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે.
આકૃતિ 2. લેથ એસેમ્બલીનો સ્કીમ ફ્લો
મોક બેક્ટેરિયા મિશ્રણ સાથે લેથનું મૂલ્યાંકન
એમએજી એસેમ્બલીમાં નેનોપોર સિક્વન્સિંગ પ્લેટફોર્મ અને લેથની કામગીરીનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે ગ્રામ-પોઝિટિવ અને ગ્રામ-નેગેટિવ બેક્ટેરિયા ધરાવતા પ્રમાણભૂત ATCC 12-પ્રજાતિના મિશ્રણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.નેનોપોર પ્લેટફોર્મ દ્વારા 5.9 kb ના N50 સાથે કુલ 30.3 Gb ડેટા જનરેટ કરવામાં આવ્યો હતો.લેથે મોટાભાગે એસેમ્બલી N50 ને અન્ય લોંગ-રીડ એસેમ્બલી ટૂલ્સની સરખામણીમાં 1.6 થી 4-ગણો અને હાઇબ્રિડ એસેમ્બલી ટૂલ્સની સરખામણીમાં 2 થી 9-ગણો સુધારેલ છે.12 બેક્ટેરિયલ જિનોમમાંથી, સાતને સિંગલ કોન્ટિગ્સમાં એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા (આકૃતિ 3. કાળા ટપકાંવાળા સર્કોસ).ત્રણ વધુને ચાર અથવા ઓછા કોન્ટિગ્સમાં એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા, જેમાં સૌથી અપૂર્ણ એસેમ્બલીમાં એક જ કોન્ટિગમાં જીનોમનો 83% ભાગ હતો.
આકૃતિ 3. નિર્ધારિત 12-જાતિના બેક્ટેરિયલ મિશ્રણમાં જીનોમ એસેમ્બલી
સ્ટૂલના નમૂનાઓમાં લેથનો ઉપયોગ
હાલની પદ્ધતિઓ, રીડ-ક્લાઉડ અને શોર્ટ-રીડ આધારિત વિશ્લેષણ સાથે જીવતંત્રની ઓળખ અને એસેમ્બલી સુસંગતતાની તુલના કરવા માટે આ પદ્ધતિ વધુ માનવ સ્ટૂલ નમૂનાઓ પર લાગુ કરવામાં આવી હતી.સામેલ ત્રણ નમૂનાઓમાંથી, નવા એન્ઝાઇમ-આધારિત નિષ્કર્ષણથી ઇનપુટ માસના 300 મિલિગ્રામ દીઠ ઓછામાં ઓછા 1 μg પ્રાપ્ત થયું.આ HMW DNA ના નેનોપોર સિક્વન્સિંગ અનુક્રમે 4.7 kb, 3.0kb અને 3.0kb ના N50 સાથે લાંબા-રીડ જનરેટ કરે છે.નોંધનીય રીતે, અસ્તિત્વમાં રહેલી પદ્ધતિઓની તુલનામાં વર્તમાન પદ્ધતિએ માઇક્રોબાયલ શોધમાં મોટી સંભાવના દર્શાવી છે.શોર્ટ-રીડ અને રીડ-ક્લાઉડની સરખામણીમાં અહીં સાપેક્ષ રીતે ઉચ્ચ પ્રજાતિ-સ્તરની આલ્ફા વિવિધતા દર્શાવવામાં આવી હતી.તદુપરાંત, ટૂંકા-વાંચેલા વિશ્લેષણમાંથી તમામ જાતિઓ, સામાન્ય રીતે લિસિસ-પ્રતિરોધક ગ્રામ-પોઝિટિવ જીવો પણ, આ પદ્ધતિ દ્વારા પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં આવ્યા હતા.
આકૃતિ 4. નેનોપોર, શોર્ટ-રીડ અને રીડ-ક્લાઉડ પદ્ધતિઓ દ્વારા નિર્ધારિત આલ્ફા વિવિધતા અને ટેક્સનોમિક ઘટકો
કાચા ડેટાના ત્રણથી છ ગણા નીચા ઇનપુટ હોવા છતાં, લેથ ટૂંકા-વાંચવા અને વાંચવા-ક્લાઉડ એસેમ્બલી કરતાં ઘણી લાંબી સંપૂર્ણ-એસેમ્બલી N50 પેદા કરે છે.ડ્રાફ્ટ જીનોમનું નિર્માણ કોન્ટિગ બિનિંગ દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું, જેમાં ડ્રાફ્ટને પૂર્ણતા, દૂષણ, સિંગલ-કોપી કોર જનીન વગેરેના આધારે "ઉચ્ચ-ગુણવત્તા" અથવા "આંશિક" માં વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા. લાંબા સમયથી વાંચેલી એસેમ્બલીએ સરખામણીમાં ઓછી કિંમતે ઘણી ઊંચી સંલગ્નતા દર્શાવી હતી. ટૂંકા-વાંચવા અને વાંચવા-મેઘ માટે.
આકૃતિ 5. દરેક પદ્ધતિની સજીવ પ્રતિ એસેમ્બલી સંલગ્નતા
વધુમાં, વર્તમાન એસેમ્બલી અભિગમ બંધ, ગોળાકાર જીનોમ મેળવવા માટે સક્ષમ છે.સ્ટૂલના નમૂનાઓમાં, આઠ ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા, સિંગલ-કોન્ટિગ જીનોમ્સ એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા અને તેમાંથી પાંચે ચોક્કસ પરિપત્ર પ્રાપ્ત કર્યું હતું.જીનોમમાં પુનરાવર્તિત તત્વોના નિરાકરણમાં લાંબા સમય સુધી વાંચવાના અભિગમે પ્રભાવશાળી ક્ષમતા પણ દર્શાવી છે.પરિપત્રિતપી. કોપ્રીજિનોમ આ અભિગમ દ્વારા જનરેટ કરવામાં આવ્યો હતો, જેમાં ઉચ્ચ-અંતર ક્રમ પુનરાવર્તન સમાવવા માટે જાણીતું છે.શોર્ટ-રીડ અને રીડ-ક્લાઉડ દ્વારા આ જિનોમની શ્રેષ્ઠ એસેમ્બલી 4800X ની કવરેજ ઊંડાઈ સાથે પણ ક્યારેય 130 kb ના N50 થી વધી નથી.આ ઉચ્ચ કોપી નંબર તત્વો લાંબા-વાંચવાના અભિગમ દ્વારા સંપૂર્ણ રીતે ઉકેલાઈ ગયા હતા, જે મોટાભાગે શોર્ટ-રીડ અથવા રીડ-ક્લાઉડ એસેમ્બલીના બ્રેકિંગ પોઈન્ટ્સ પર જોવા મળે છે.આ અભ્યાસમાં અન્ય બંધ જીનોમની જાણ કરવામાં આવી હતી, જે તાજેતરમાં વર્ણવેલ સભ્ય હોવાનું માનવામાં આવતું હતુંસિબાયોબેક્ટરક્લેડઆ બંધ એસેમ્બલીમાં 8.5 થી 65.9 kb સુધીના પાંચ પુટેટિવ ફેજની ઓળખ કરવામાં આવી હતી.
આકૃતિ 6. P.copri અને Cibiobacter sp ના બંધ જીનોમનું સર્કોસ ડાયાગ્રામ.
સંદર્ભ
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).નેનોપોર સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ કરીને માઇક્રોબાયોમ્સમાંથી સંપૂર્ણ, બંધ બેક્ટેરિયલ જીનોમ.કુદરત બાયોટેકનોલોજી,38(6), 701-707.
ટેક અને હાઇલાઇટ્સ વિવિધ સંશોધન ક્ષેત્રોમાં વિવિધ ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ તકનીકોની સૌથી તાજેતરની સફળ એપ્લિકેશન તેમજ પ્રાયોગિક ડિઝાઇન અને ડેટા માઇનિંગમાં તેજસ્વી વિચારોને શેર કરવાનો હેતુ છે.
પોસ્ટ સમય: જાન્યુઆરી-07-2022