METAGENOMIKO
Kompletaj, fermitaj bakteriaj genaroj de mikrobiomoj uzante nanoporan sekvencon
Nanopora Sekvencado |Metagenomics |MAGoj |Bakteria genaro cirkuligo |Intesta mikrobioto
Elstaraĵoj
1.Nova metodo por ĉerpi longajn fragmentojn de DNA estis prezentita en ĉi tiu studo, kiu atingis eltiron de mikrogramo de pura, HMW DNA taŭga por longelega sinsekvo el 300 mg da feko.
2.Asemblea laborfluo, Tornilo, estis enkondukita en ĉi tiu studo, kie MAGoj estis kunvenitaj per longaj legadoj kaj korektitaj per mallongaj legadoj.
3.Lathe estis taksita per imita miksaĵo.7 el 12 bakterioj estis sukcese kunvenitaj en ununurajn kontigs kaj 3 estis kunvenitaj en kvar aŭ malpli da kontigs.
4.Tornilo estis plu aplikita al feko-provaĵoj, kiuj generis 20 cirkuligitajn genarojn, inkluzive de Prevotella copri kaj kandidaton Cibiobacter sp., kiuj estis konataj pro esti riĉaj je moveblaj genetikaj elementoj.
Ĉefa Atingo
Eltira protokolo por HWM DNA
Long-legataj sekvencado bazitaj intestaj metagenomaj studoj estis longe suferitaj de malmoleco en eltirado de alta molekula pezo (HMW) DNA de feko.En ĉi tiu studo, enzim-bazita ekstrakta protokolo estis lanĉita por eviti ampleksan tondilon per perlbatado en tradiciaj metodoj.Kiel montrite en la sekva figuro, la specimenoj estis unue traktitaj per koktelo de enzimoj, inkluzive de litika enzimo, MetaPolyzyme, ktp. por degradi ĉelmurojn.Liberigita DNA estis ĉerpita per Fenol-kloroforma sistemo, sekvita de Proteinase K kaj RNase A-digestado, kolumn-bazita purigo kaj SPRI-grandecelekto.Ĉi tiu metodo sukcesis doni mikrogramojn da HMW-DNA el 300 m da feko, kiu plenumas longlegitajn sekvencpostulojn laŭ kvalito kaj kvanto.
Figuro 1. HWM DNA-eltira skemo
Skemo fluo de Tornilo
Kiel priskribite en la sekva figuro, Tornilo enhavas ekzistantan procezon de kruda bazvoka procezo uzante Guppy.Du long-legitaj asembleoj tiam estas produktitaj fare de Flye kaj Canu aparte sekvitaj per mis-kunigo detekto kaj forigo.La du subasembleoj estas kunfanditaj kun rapida kunigo.Sur kunfandiĝo, grandaj asembleoj sur megabaznivelo tiam estas kontrolitaj por cirkuligo.Poste, konsenta rafinado pri ĉi tiuj asembleoj estas prilaborita per mallongaj legaĵoj.Finaj kunvenitaj bakteriaj genaroj estas prilaboritaj por fina mis-kunigdetekto kaj forigo.
Figuro 2. Skema fluo de Tornilo-asembleo
Taksado de Tornilo kun imita bakteria miksaĵo
Norma ATCC 12-specia miksaĵo konsistanta el kaj Gram-pozitivaj kaj Gram-negativaj bakterioj estis utiligita por analizi la efikecon de nanopora sekvenca platformo kaj Tornilo en MAG-asembleo.Entute 30.3 Gb-datenoj estis generita per nanopora platformo kun N50 de 5.9 kb.Tornilo plejparte plibonigis asembleon N50 al 1,6 ĝis 4-obla kompare kun aliaj longlegeblaj asembleaj iloj kaj 2 ĝis 9-obla kompare kun hibridaj asembleaj iloj.El 12 bakteriaj genaroj, sep estis kunvenitaj en ununurajn kontigojn (Figuro 3. Cirkoj kun nigra punkto).Tri pliaj estis kunvenitaj en kvar aŭ malpli da kontig, en kiuj la plej nekompleta kunigo enhavis 83% de la genaro en ununura kontig.
Figuro 3. Genomasembleoj en difinita 12-specia bakteria miksaĵo
Apliko de Tornilo en specimenoj de tabureto
Ĉi tiu metodo estis plue aplikita al homaj fekoprovaĵoj por kompari la organismo-identigon kaj kunigan apudecon al ekzistantaj metodoj, leg-nubo kaj mallonglega analizo.El la tri provaĵoj implikitaj, la nova enzim-bazita eltiro donis almenaŭ 1 μg per 300 mg da eniga maso.Nanopora sekvencado de ĉi tiuj HMW DNA generis longajn legadojn kun N50 de 4.7 kb, 3.0kb kaj 3.0kb respektive.Precipe, nuna metodo montris grandan potencialon en mikroba detekto kompare kun ekzistantaj metodoj.Relative pli alta specio-nivela alfa-diverseco estis montrita ĉi tie kompare kun mallonglega kaj legita nubo.Krome, ĉiuj genroj de mallonglega analizo, eĉ tipe lizorezistaj Gram-pozitivaj organismoj, estis reakiritaj per tiu metodo.
Figuro 4. Alfa-diverseco kaj taksonomiaj komponentoj determinitaj per Nanopore, mallonglegaj kaj leg-nubaj metodoj
Tornilo donis multe pli longan tut-asembleon N50 ol mallonglega kaj legi-nuba asembleo, malgraŭ tri ĝis sesobla pli malalta enigo de krudaj datumoj.Malnetaj genaroj estis produktitaj per kontigbinning, en kiu la skizoj estis klasifikitaj en "altkvalitajn" aŭ "partajn" surbaze de kompleteco, poluado, unu-kopiaj kernaj genoj, ktp. Long-lega kunigo montris multe pli altan apudecon je pli malalta kosto kompare. al mallonge legi kaj legi-nubo.
Figuro 5. Per-organisma asembleo de ĉiu metodo
Krome, nuna asemblea aliro kapablas doni fermitajn, cirkulajn genarojn.En la fekoprovaĵoj, ok altkvalitaj, unu-kontig genaroj estis kunvenitaj kaj kvin el tiuj atingis precizan cirkuligon.Long-lega aliro ankaŭ montris imponan kapablon en solvado de ripetemaj elementoj en genaroj.CirkularigitaP. coprigenaro estis generita per tiu aliro, kiu povas enhavi altgradan sekvencoripeton.La plej bona asembleo de ĉi tiu genaro per mallonga legado kaj legado-nubo neniam superis N50 de 130 kb, eĉ kun kovroprofundo de 4800X.Ĉi tiuj altaj kopiaj nombro-elementoj estis plene solvitaj per longlega aliro, kiu ofte troviĝas ĉe rompopunktoj de mallonglegaj aŭ leg-nubaj asembleoj.Alia fermita genaro estis raportita en ĉi tiu studo, kiu verŝajne estis membro de lastatempe priskribitaCibiobacterklado.Kvin supozaj fagoj estis identigitaj en tiu fermita kunigo, intervalante de 8,5 ĝis 65,9 kb.
Figuro 6. Circos-diagramo de fermitaj genaroj de P.copri kaj Cibiobacter sp.
Referenco
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Kompletaj, fermitaj bakteriaj genaroj de mikrobiomoj uzante nanoporan sekvencon.Naturbioteknologio,38(6), 701-707.
Tekniko kaj Kulminaĵoj celas kunhavigi plej lastatempan sukcesan aplikon de malsamaj alt-trafikaj sekvencaj teknologioj en diversaj esplorkampoj same kiel brilajn ideojn en eksperimenta dezajno kaj datumminado.
Afiŝtempo: Jan-07-2022