FJARÐARFRÆÐI
Fullkomið, lokað erfðamengi bakteríu úr örverum með nanopore raðgreiningu
Nanopore raðgreining |Metagenomics |MAGs |Genamengi bakteríuhringrásar |Þarma örvera
Hápunktar
1. Ný aðferð til að draga út langa DNA-búta var kynnt í þessari rannsókn, sem náði til útdráttar á míkrógrömmum af hreinu, HMW DNA sem hentar til langlestrar raðgreiningar úr 300 mg af hægðum
2.Samsetningarverkflæði, Rennibekkur, var kynnt í þessari rannsókn, þar sem MAGs voru settir saman með löngum lestum og leiðrétt með stuttum lestum.
3.Rennibekkur var metinn með sýndarblöndu.7 af 12 bakteríum tókst að setja saman í staka samstæðu og 3 voru settar saman í fjóra eða færri samstæður.
4.Rennibekkur var frekar beitt á hægðasýni, sem mynduðu 20 hringlaga erfðamengi, þar á meðal Prevotella copri og frambjóðanda Cibiobacter sp., sem voru þekkt fyrir að vera rík af hreyfanlegum erfðaþáttum.
Helstu afrek
Útdráttaraðferð fyrir HWM DNA
Langlestrar raðgreiningar byggðar á metagenomic rannsóknum í þörmum hefur lengi verið þjáð af hörku við að draga DNA með mikilli mólþunga (HMW) úr hægðum.Í þessari rannsókn var útdráttaraðferð sem byggir á ensímum kynnt til að forðast umfangsmikla klippingu með perluhögg með hefðbundnum aðferðum.Eins og sést á meðfylgjandi mynd voru sýnin fyrst meðhöndluð með kokteil af ensímum, þar á meðal lytic ensím, MetaPolyzyme, o.fl. til að brjóta niður frumuveggi.Losað DNA var dregið út með fenól-klóróformkerfi, fylgt eftir með próteinasa K og RNase A meltingu, súlubundinni hreinsun og SPRI stærðarvali.Þessi aðferð náði að skila míkrógrömmum af HMW DNA úr 300 m hægðum, sem uppfyllir langlestrar raðgreiningarkröfur bæði hvað varðar gæði og magn.
Mynd 1. HWM DNA útdráttarkerfi
Scheme flæði rennibekkur
Eins og lýst er á eftirfarandi mynd inniheldur rennibekkurinn núverandi ferli við hráan grunnkallaferli með því að nota Guppy.Tvær langlesnar samsetningar eru síðan framleiddar af Flye og Canu í sitthvoru lagi, fylgt eftir með því að greina missamsetningu og fjarlægja.Undireiningarnar tvær eru sameinaðar Quickmerge.Við sameiningu eru stórar samsetningar á megabasastigi síðan athugaðar með hringrás.Í kjölfarið er unnið að því að fá samstöðu um þessi þing með stuttum lestri.Endanleg samansett erfðamengi baktería eru unnin til að greina og fjarlægja endanlega missamsetningu.
Mynd 2. Scheme flæði rennibekkur samkoma
Mat á rennibekk með gerlablöndu
Stöðluð ATCC 12 tegunda blanda sem samanstendur af bæði Gram-jákvæðum og Gram-neikvæðum bakteríum var notuð til að meta frammistöðu nanopore raðgreiningarvettvangs og rennibekks í MAG samsetningu.Alls voru 30,3 Gb gögn búin til af nanopore vettvangi með N50 5,9 kb.Rennibekkur bætti samsetningu N50 að miklu leyti í 1,6 til 4-falt miðað við önnur langlestra samsetningarverkfæri og 2 til 9-falt miðað við blended samsetningarverkfæri.Af 12 erfðamengi baktería voru sjö sett saman í staka samstæðu (Mynd 3. Circos með svörtum punkti).Þrír til viðbótar voru settir saman í fjóra eða færri samstæður, þar sem ófullkomnasta samsetningin innihélt 83% af erfðamenginu í einum contig.
Mynd 3. Erfðamengissamsetningar í skilgreindri 12 tegunda bakteríublöndu
Notkun rennibekkur í hægðasýnum
Þessari aðferð var beitt frekar á hægðasýni úr mönnum til að bera saman auðkenningu lífveru og samsetningu við núverandi aðferðir, lesskýja- og stuttlestrargreiningar.Úr sýnunum þremur sem um ræðir gaf nýja ensím-undirstaða útdrátturinn að minnsta kosti 1 μg á 300 mg af inntaksmassa.Nanopore raðgreining þessara HMW DNA myndaði langa lestur með N50 upp á 4,7 kb, 3,0 kb og 3,0 kb í sömu röð.Sérstaklega sýndi núverandi aðferð mikla möguleika í uppgötvun örvera miðað við aðferðir sem fyrir voru.Tiltölulega meiri alfafjölbreytileiki á tegundastigi var sýndur hér samanborið við stuttlestur og lesský.Þar að auki voru allar ættkvíslir úr skammlestri greiningu, jafnvel venjulega ljósþolnar Gram-jákvæðar lífverur, endurheimtar með þessari aðferð.
Mynd 4. Alfa fjölbreytileiki og flokkunarfræðilegir þættir ákvarðaðir með Nanopore, stuttlestri og lesskýjaaðferðum
Rennibekkur skilaði miklu lengri heildarsamsetningu N50 en skammlestrar- og lesskýjasamsetningu, þrátt fyrir þrefalt til sexfalt lægra inntak af hráum gögnum.Drög að erfðamengi voru framleidd með contig binning, þar sem drögin voru flokkuð í „hágæða“ eða „að hluta“ á grundvelli heilleika, mengunar, eintaks kjarnagena o.s.frv. að stutt-lesa og lesa-ský.
Mynd 5. Samsetning hverrar lífveru fyrir hverja aðferð
Þar að auki er núverandi samsetningaraðferð fær um að skila lokuðu, hringlaga erfðamengi.Í hægðasýnunum voru átta hágæða einsamsett erfðamengi sett saman og fimm þeirra náðu nákvæmri hringrás.Langlestur nálgun sýndi einnig glæsilega getu til að leysa endurtekna þætti í erfðamengi.HringlagaP. coprierfðamengi var myndað með þessari aðferð, sem hefur verið vitað að innihalda mikla endurtekningu raða.Besta samsetning þessa erfðamengis með stuttum lestri og lesskýi fór aldrei yfir N50 upp á 130 kb, jafnvel með þekjudýpt 4800X.Þessir þættir með mikla afritafjölda voru að fullu leystir með langlestri nálgun, sem oft fannst við brotpunkta í stuttlestri eða lesskýjasamstæðum.Tilkynnt var um annað lokað erfðamengi í þessari rannsókn, sem talið var að væri aðili að nýlega lýstCibiobacterklæða.Fimm hugsanlegir fagur voru auðkenndir í þessari lokuðu samsetningu, allt frá 8,5 til 65,9 kb.
Mynd 6. Circos skýringarmynd af lokuðum erfðamengi P.copri og Cibiobacter sp.
Tilvísun
Moss, EL, Maghini, DG og Bhatt, AS (2020).Fullkomið, lokað erfðamengi bakteríu úr örverum með nanopore raðgreiningu.Líftækni náttúrunnar,38(6), 701-707.
Tækni og hápunktur miðar að því að deila nýjustu farsælu beitingu mismunandi raðgreiningartækni með mikilli afköstum á ýmsum rannsóknarvettvangi sem og frábærum hugmyndum í tilraunahönnun og gagnavinnslu.
Pósttími: Jan-07-2022