मेटाजेनोमिक्स
नैनोपोर अनुक्रमण का उपयोग करके माइक्रोबायोम से पूर्ण, बंद जीवाणु जीनोम
नैनोपोर अनुक्रमण |मेटागेनोमिक्स |पत्रिकाएँ |बैक्टीरियल जीनोम सर्कुलराइजेशन |आंत माइक्रोबायोटा
हाइलाइट
1.इस अध्ययन में डीएनए के लंबे टुकड़े निकालने की एक नई विधि प्रस्तुत की गई, जिससे 300 मिलीग्राम मल से लंबे समय तक पढ़े जाने वाले अनुक्रमण के लिए उपयुक्त माइक्रोग्राम शुद्ध एचएमडब्ल्यू डीएनए का निष्कर्षण प्राप्त हुआ।
2. इस अध्ययन में एक असेंबली वर्कफ़्लो, लेथ, पेश किया गया था, जहां एमएजी को लंबी रीडिंग द्वारा इकट्ठा किया गया था और छोटी रीडिंग द्वारा सही किया गया था।
3. लेथ का मूल्यांकन मॉक मिश्रण द्वारा किया गया।12 में से 7 बैक्टीरिया को सफलतापूर्वक एकल कंटिग्स में इकट्ठा किया गया और 3 को चार या उससे कम कंटिग्स में इकट्ठा किया गया।
4.मल के नमूनों पर खराद का प्रयोग किया गया, जिससे 20 गोलाकार जीनोम उत्पन्न हुए, जिनमें प्रीवोटेला कोप्री और कैंडिडेट सिबियोबैक्टर एसपी शामिल थे।, जो गतिशील आनुवंशिक तत्वों से समृद्ध होने के लिए जाने जाते थे।
मुख्य उपलब्धि
एचडब्ल्यूएम डीएनए के लिए निष्कर्षण प्रोटोकॉल
लंबे समय से पढ़े जाने वाले अनुक्रमण आधारित आंत मेटागेनोमिक अध्ययन लंबे समय से मल से उच्च आणविक भार (एचएमडब्ल्यू) डीएनए निकालने में कठोरता से पीड़ित हैं।इस अध्ययन में, पारंपरिक तरीकों से मनका पीटकर व्यापक कतरनी से बचने के लिए एक एंजाइम-आधारित निष्कर्षण प्रोटोकॉल पेश किया गया था।जैसा कि निम्नलिखित चित्र में दिखाया गया है, कोशिका की दीवारों को ख़राब करने के लिए नमूनों को सबसे पहले एंजाइमों के कॉकटेल के साथ इलाज किया गया था, जिसमें लाइटिक एंजाइम, मेटापॉलीज़ाइम आदि शामिल थे।जारी डीएनए को फिनोल-क्लोरोफॉर्म प्रणाली द्वारा निकाला गया, इसके बाद प्रोटीनेज़ K और RNase A पाचन, स्तंभ-आधारित शुद्धि और SPRI आकार का चयन किया गया।यह विधि 300 मीटर मल से एचएमडब्ल्यू डीएनए के माइक्रोग्राम प्राप्त करने में कामयाब रही, जो गुणवत्ता और मात्रा दोनों के संदर्भ में लंबे समय से पढ़ी जाने वाली अनुक्रमण आवश्यकताओं को पूरा करती है।
चित्र 1. एचडब्ल्यूएम डीएनए निष्कर्षण योजना
खराद की योजना प्रवाह
जैसा कि निम्नलिखित चित्र में बताया गया है, लेथ में गप्पी का उपयोग करके रॉ बेसकॉलिंग प्रक्रिया की मौजूदा प्रक्रिया शामिल है।दो लंबे समय से पढ़ी जाने वाली असेंबली को फ्लाई और कैनु द्वारा अलग-अलग तैयार किया जाता है, जिसके बाद गलत असेंबली का पता लगाया जाता है और हटा दिया जाता है।दो उप-असेंबली को क्विकमर्ज के साथ मिला दिया गया है।विलय के बाद, मेगाबेस स्तर पर बड़ी असेंबली को सर्कुलराइजेशन के लिए जांचा जाता है।इसके बाद, इन असेंबली पर सर्वसम्मति परिशोधन को संक्षिप्त पठन के साथ संसाधित किया जाता है।अंतिम असेंबल किए गए जीवाणु जीनोम को अंतिम गलत-असेंबली का पता लगाने और हटाने के लिए संसाधित किया जाता है।
चित्र 2. लेथ असेंबली का योजना प्रवाह
मॉक बैक्टीरिया मिश्रण के साथ लेथ का मूल्यांकन
एमएजी असेंबली में नैनोपोर अनुक्रमण प्लेटफॉर्म और लेथ के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव दोनों बैक्टीरिया वाले एक मानक एटीसीसी 12-प्रजाति मिश्रण को नियोजित किया गया था।5.9 केबी के एन50 के साथ नैनोपोर प्लेटफॉर्म द्वारा कुल 30.3 जीबी डेटा उत्पन्न किया गया था।लेथ ने बड़े पैमाने पर असेंबली N50 को अन्य लंबे समय से पढ़े जाने वाले असेंबली टूल्स की तुलना में 1.6 से 4 गुना और हाइब्रिड असेंबली टूल्स की तुलना में 2 से 9 गुना तक बेहतर बनाया है।12 जीवाणु जीनोम में से सात को एकल कंटिग्स में इकट्ठा किया गया था (चित्रा 3. काले बिंदु के साथ सर्कोस)।तीन और को चार या उससे कम कॉन्टिग्स में इकट्ठा किया गया था, जिसमें सबसे अपूर्ण असेंबली में एक ही कॉन्टिग्स में 83% जीनोम था।
चित्र 3. एक परिभाषित 12-प्रजाति के जीवाणु मिश्रण में जीनोम संयोजन
मल के नमूनों में खराद का अनुप्रयोग
मौजूदा तरीकों, रीड-क्लाउड और शॉर्ट-रीड आधारित विश्लेषण के साथ जीव की पहचान और असेंबली निकटता की तुलना करने के लिए इस पद्धति को मानव मल के नमूनों पर भी लागू किया गया था।शामिल तीन नमूनों से, नए एंजाइम-आधारित निष्कर्षण से प्रति 300 मिलीग्राम इनपुट द्रव्यमान में कम से कम 1 μg प्राप्त हुआ।इन एचएमडब्ल्यू डीएनए की नैनोपोर अनुक्रमण ने क्रमशः 4.7 केबी, 3.0 केबी और 3.0 केबी के एन50 के साथ लंबी-रीड उत्पन्न की।उल्लेखनीय रूप से, मौजूदा पद्धति ने मौजूदा पद्धतियों की तुलना में माइक्रोबियल पहचान में काफी संभावनाएं दिखाई हैं।शॉर्ट-रीड और रीड-क्लाउड की तुलना में अपेक्षाकृत उच्च प्रजाति-स्तरीय अल्फा विविधता यहां दिखाई गई थी।इसके अलावा, लघु-पठित विश्लेषण से सभी जेनेरा, यहां तक कि आमतौर पर लसीका-प्रतिरोधी ग्राम-पॉजिटिव जीव भी, इस विधि द्वारा पुनर्प्राप्त किए गए थे।
चित्र 4. नैनोपोर, शॉर्ट-रीड और रीड-क्लाउड विधियों द्वारा निर्धारित अल्फा विविधता और टैक्सोनोमिक घटक
कच्चे डेटा के तीन से छह गुना कम इनपुट के बावजूद, लेथ ने शॉर्ट-रीड और रीड-क्लाउड असेंबली की तुलना में अधिक लंबे समय तक पूर्ण-असेंबली N50 का उत्पादन किया।ड्राफ्ट जीनोम का निर्माण कॉन्टिग बिनिंग द्वारा किया गया था, जिसमें ड्राफ्ट को पूर्णता, संदूषण, एकल-प्रतिलिपि कोर जीन आदि के आधार पर "उच्च-गुणवत्ता" या "आंशिक" में वर्गीकृत किया गया था। लंबे समय से पढ़ी गई असेंबली ने तुलना में कम लागत पर बहुत अधिक निकटता दिखाई संक्षिप्त-पढ़ने और पढ़ने-क्लाउड करने के लिए।
चित्र 5. प्रत्येक विधि की प्रति-जीव असेंबली सन्निहितता
इसके अलावा, वर्तमान असेंबली दृष्टिकोण बंद, गोलाकार जीनोम उत्पन्न करने में सक्षम है।मल के नमूनों में, आठ उच्च गुणवत्ता वाले, एकल-कॉन्टिग जीनोम इकट्ठे किए गए और इनमें से पांच ने पर्सिस सर्कुलराइजेशन हासिल किया।लंबे समय तक पढ़े गए दृष्टिकोण ने जीनोम में दोहराए जाने वाले तत्वों को हल करने में प्रभावशाली क्षमता भी दिखाई।परिपत्रितपी. कोपरीइस दृष्टिकोण द्वारा जीनोम तैयार किया गया था, जिसे उच्च स्तर के अनुक्रम दोहराव के लिए जाना जाता है।शॉर्ट-रीड और रीड-क्लाउड द्वारा इस जीनोम की सबसे अच्छी असेंबली कभी भी 130 केबी के एन50 से अधिक नहीं हुई, यहां तक कि 4800X की कवरेज गहराई के साथ भी।इन उच्च प्रतिलिपि संख्या तत्वों को लंबे समय तक पढ़ने वाले दृष्टिकोण द्वारा पूरी तरह से हल किया गया था, जो अक्सर शॉर्ट-रीड या रीड-क्लाउड असेंबली के ब्रेकिंग पॉइंट पर पाए जाते थे।इस अध्ययन में एक और बंद जीनोम की सूचना दी गई, जिसे हाल ही में वर्णित का सदस्य माना गयासिबियोबैक्टरक्लैड.इस बंद असेंबली में 8.5 से 65.9 केबी तक के पांच अनुमानित फ़ेज़ की पहचान की गई थी।
चित्र 6. पी.कोप्री और सिबियोबैक्टर एसपी के बंद जीनोम का सर्कोस आरेख।
संदर्भ
मॉस, ईएल, माघिनी, महानिदेशक, और भट्ट, एएस (2020)।नैनोपोर अनुक्रमण का उपयोग करके माइक्रोबायोम से पूर्ण, बंद जीवाणु जीनोम।प्रकृति जैव प्रौद्योगिकी,38(6), 701-707.
टेक और हाइलाइट्स इसका उद्देश्य विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में विभिन्न उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के नवीनतम सफल अनुप्रयोग के साथ-साथ प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा खनन में शानदार विचारों को साझा करना है।
पोस्ट समय: जनवरी-07-2022