मेटाजेनॉमिक्स
नॅनोपोर सिक्वेन्सिंग वापरून मायक्रोबायोममधून पूर्ण, बंद जिवाणू जीनोम
नॅनोपोर सिक्वेन्सिंग |मेटाजेनोमिक्स |MAGs |जिवाणू जीनोम परिपत्रक |आतड्याचा मायक्रोबायोटा
ठळक मुद्दे
1. या अभ्यासात डीएनएचे लांब तुकडे काढण्याची एक अभिनव पद्धत सादर केली गेली, ज्याने 300 मिलीग्राम स्टूलमधून दीर्घ-वाचनीय अनुक्रमांसाठी योग्य शुद्ध, एचएमडब्ल्यू डीएनएचा मायक्रोग्राम काढला.
2.या अभ्यासात एक असेंबली वर्कफ्लो, लेथ, सादर करण्यात आला, जेथे MAGs लाँग रीडद्वारे एकत्र केले गेले आणि शॉर्ट-रीड्सद्वारे दुरुस्त केले गेले.
3.लॅथचे मुल्यांकन मॉक मिश्रणाद्वारे करण्यात आले.12 पैकी 7 जीवाणू यशस्वीरित्या एकल कॉन्टिग्जमध्ये एकत्र केले गेले आणि 3 चार किंवा त्यापेक्षा कमी कॉन्टिग्जमध्ये एकत्र केले गेले.
4. स्टूलच्या नमुन्यांवर पुढे लेथ लागू केले गेले, ज्याने प्रीव्होटेला कॉप्री आणि उमेदवार सिबिओबॅक्टर एसपीसह 20 वर्तुळाकार जीनोम तयार केले., जे मोबाइल अनुवांशिक घटकांनी समृद्ध म्हणून ओळखले जात होते.
मुख्य उपलब्धी
HWM DNA साठी एक्सट्रॅक्शन प्रोटोकॉल
स्टूलमधून उच्च आण्विक वजन (HMW) DNA काढण्यात दीर्घ-वाचनीय अनुक्रम आधारित आतडे मेटाजेनोमिक अभ्यासांना दीर्घकाळापासून कठोरपणाचा सामना करावा लागला आहे.या अभ्यासात, पारंपारिक पद्धतींमध्ये मणी मारून मोठ्या प्रमाणात कातरणे टाळण्यासाठी एन्झाइम-आधारित निष्कर्षण प्रोटोकॉल सादर करण्यात आला.खालील आकृतीत दर्शविल्याप्रमाणे, सेलच्या भिंती खराब करण्यासाठी नमुन्यांवर प्रथम एन्झाईमच्या कॉकटेलसह उपचार केले गेले, ज्यामध्ये लायटिक एन्झाइम, मेटापॉलीझाइम इ.रिलीझ केलेला डीएनए फिनॉल-क्लोरोफॉर्म प्रणालीद्वारे काढला गेला, त्यानंतर प्रोटीनेज के आणि आरनेज ए पचन, स्तंभ-आधारित शुद्धीकरण आणि एसपीआरआय आकार निवड.या पद्धतीमुळे 300 मीटर स्टूलमधून HMW DNA चे मायक्रोग्राम मिळू शकले, जे गुणवत्ता आणि प्रमाण या दोन्ही बाबतीत दीर्घ-वाचलेल्या अनुक्रमांची आवश्यकता पूर्ण करते.
आकृती 1. HWM DNA काढण्याची योजना
लेथची योजना प्रवाह
खालील आकृतीमध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, लेथमध्ये गप्पी वापरून रॉ बेसकॉलिंग प्रक्रियेची विद्यमान प्रक्रिया समाविष्ट आहे.दोन लाँग-रीड असेंब्ली नंतर फ्लाय आणि कॅनू स्वतंत्रपणे तयार करतात आणि त्यानंतर चुकीचे असेंब्ली शोधणे आणि काढून टाकणे.दोन उप-असेंबली जलद विलीन करून एकत्र केल्या जातात.विलीन केल्यावर, मेगाबेस स्तरावरील मोठ्या असेंब्ली नंतर परिपत्रकासाठी तपासल्या जातात.त्यानंतर, या असेंब्लींवर एकमत शुद्धीकरण लहान वाचनासह प्रक्रिया केली जाते.अंतिम एकत्रित केलेल्या बॅक्टेरियाच्या जीनोमवर अंतिम चुकीचे असेंब्ली शोधण्यासाठी आणि काढण्यासाठी प्रक्रिया केली जाते.
आकृती 2. लेथ असेंबलीची योजना प्रवाह
मॉक बॅक्टेरिया मिश्रणासह लेथचे मूल्यांकन
एमएजी असेंब्लीमध्ये नॅनोपोर सिक्वेन्सिंग प्लॅटफॉर्म आणि लेथच्या कार्यक्षमतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी ग्राम-पॉझिटिव्ह आणि ग्राम-नकारात्मक दोन्ही बॅक्टेरिया असलेले मानक ATCC 12-प्रजातींचे मिश्रण वापरले गेले.5.9 kb च्या N50 सह नॅनोपोर प्लॅटफॉर्मद्वारे एकूण 30.3 Gb डेटा व्युत्पन्न झाला.इतर लाँग-रीड असेंब्ली टूल्सच्या तुलनेत लेथने असेंबली N50 1.6 ते 4 पट आणि हायब्रीड असेंबली टूल्सच्या तुलनेत 2 ते 9-पट सुधारली.12 जिवाणू जीनोमपैकी सात एकल कॉन्टिग्जमध्ये एकत्र केले गेले (आकृती 3. काळ्या बिंदूसह सर्कस).आणखी तीन चार किंवा त्यापेक्षा कमी कॉन्टिगमध्ये एकत्र केले गेले, ज्यामध्ये सर्वात अपूर्ण असेंब्लीमध्ये एकाच कॉन्टिगमध्ये 83% जीनोम समाविष्ट होते.
आकृती 3. परिभाषित 12-प्रजातींच्या जिवाणू मिश्रणात जीनोम असेंब्ली
स्टूलच्या नमुन्यांमध्ये लेथचा वापर
अस्तित्वात असलेल्या पद्धती, रीड-क्लाउड आणि शॉर्ट-रीड आधारित विश्लेषणाशी जीव ओळखणे आणि असेंबली कॉन्टिग्युटीची तुलना करण्यासाठी ही पद्धत पुढे मानवी स्टूलच्या नमुन्यांवर लागू केली गेली.समाविष्ट असलेल्या तीन नमुन्यांमधून, नवीन एंजाइम-आधारित निष्कर्षणातून किमान 1 μg प्रति 300 mg इनपुट वस्तुमान मिळाले.या HMW DNA च्या नॅनोपोर सिक्वेन्सिंगने अनुक्रमे 4.7 kb, 3.0kb आणि 3.0kb चे N50 लाँग-रीड तयार केले.विशेष म्हणजे, अस्तित्वात असलेल्या पद्धतींच्या तुलनेत सध्याच्या पद्धतीमध्ये सूक्ष्मजीव शोधण्याची मोठी क्षमता दिसून आली आहे.शॉर्ट-रीड आणि रीड-क्लाउडच्या तुलनेत येथे तुलनेने उच्च प्रजाती-स्तरीय अल्फा विविधता दर्शविली गेली.शिवाय, लहान-वाचलेल्या विश्लेषणातील सर्व प्रजाती, अगदी सामान्यतः lysis-प्रतिरोधक ग्राम-पॉझिटिव्ह जीव, या पद्धतीद्वारे पुनर्प्राप्त केले गेले.
आकृती 4. नॅनोपोर, शॉर्ट-रीड आणि रीड-क्लाउड पद्धतींद्वारे निर्धारित अल्फा विविधता आणि टॅक्सनोमिक घटक
कच्च्या डेटाचे तीन ते सहा पट कमी इनपुट असूनही, शॉर्ट-रीड आणि रीड-क्लाउड असेंब्लीपेक्षा लेथने संपूर्ण-असेंबली N50 जास्त वेळ दिला.मसुदा जीनोम्स कॉन्टिग बिनिंगद्वारे तयार केले गेले, ज्यामध्ये पूर्णता, दूषितता, सिंगल-कॉपी कोर जनुक इत्यादींच्या आधारे मसुदे "उच्च-गुणवत्तेचे" किंवा "आंशिक" मध्ये वर्गीकृत केले गेले. दीर्घ-वाचलेल्या असेंबलीने तुलनेत कमी किमतीत जास्त संयोग दर्शविला. शॉर्ट-रीड आणि रीड-क्लाउड.
आकृती 5. प्रत्येक पद्धतीची प्रति-जीव असेंबली कंटिग्युटी
शिवाय, सध्याचा असेंब्ली दृष्टीकोन बंद, गोलाकार जीनोम उत्पन्न करण्यास सक्षम आहे.स्टूल नमुन्यांमध्ये, आठ उच्च-गुणवत्तेचे, सिंगल-कॉन्टीग जीनोम एकत्र केले गेले आणि यापैकी पाच अचूक परिपत्रक प्राप्त केले.जीनोममधील पुनरावृत्ती घटकांचे निराकरण करण्यासाठी दीर्घ-वाचण्याच्या दृष्टिकोनाने प्रभावी क्षमता देखील दर्शविली.परिपत्रक केलेपी. कॉप्रीया दृष्टिकोनाद्वारे जीनोम व्युत्पन्न केले गेले, ज्यामध्ये अनुक्रम पुनरावृत्तीची उच्च-डिग्री असल्याचे ज्ञात आहे.शॉर्ट-रीड आणि रीड-क्लाउडद्वारे या जीनोमची सर्वोत्तम असेंब्ली कधीही 130 kb च्या N50 पेक्षा जास्त नाही, अगदी 4800X च्या कव्हरेज खोलीसह.हे उच्च कॉपी क्रमांक घटक दीर्घ-वाचण्याच्या दृष्टिकोनाद्वारे पूर्णपणे निराकरण केले गेले, जे सहसा शॉर्ट-रीड किंवा रीड-क्लाउड असेंब्लीच्या ब्रेकिंग पॉइंट्सवर आढळतात.या अभ्यासात आणखी एक बंद जीनोम नोंदवला गेला होता, जो अलीकडेच वर्णन केलेला सदस्य असल्याचे मानले जात होतेसिबायोबॅक्टरक्लेडया बंद असेंब्लीमध्ये 8.5 ते 65.9 kb पर्यंतचे पाच पुटेटिव्ह फेज ओळखले गेले.
आकृती 6. P.copri आणि Cibiobacter sp च्या बंद जीनोमचे सर्कोस आकृती.
संदर्भ
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).नॅनोपोर सिक्वेन्सिंग वापरून मायक्रोबायोममधून पूर्ण, बंद जिवाणू जीनोम.निसर्ग जैव तंत्रज्ञान,38(6), 701-707.
टेक आणि हायलाइट्स विविध संशोधन क्षेत्रात विविध उच्च-थ्रूपुट सिक्वेन्सिंग तंत्रज्ञानाचा सर्वात अलीकडील यशस्वी अनुप्रयोग तसेच प्रायोगिक डिझाइन आणि डेटा मायनिंगमधील चमकदार कल्पना सामायिक करणे हे उद्दिष्ट आहे.
पोस्ट वेळ: जानेवारी-०७-२०२२