მეტაგენომიკა
სრული, დახურული ბაქტერიული გენომები მიკრობიომებიდან ნანოფორების თანმიმდევრობის გამოყენებით
Nanopore Sequencing |მეტაგენომიკა |MAGs |ბაქტერიული გენომის ცირკულიზაცია |ნაწლავის მიკრობიოტა
მაჩვენებლები
1. ამ კვლევაში წარმოდგენილი იყო დნმ-ის გრძელი ფრაგმენტების ამოღების ახალი მეთოდი, რომელმაც მიაღწია სუფთა, HMW დნმ-ის მიკროგრამის ექსტრაქციას, რომელიც შესაფერისია 300 მგ განავლისგან ხანგრძლივი წაკითხვისთვის.
2. ასამბლეის სამუშაო პროცესი, Lathe, დაინერგა ამ კვლევაში, სადაც MAG-ები იკრიბებოდა გრძელი წაკითხვით და შესწორებული იყო მოკლე წაკითხვით.
3. სახამებელი შეფასდა იმიტირებული ნარევით.12 ბაქტერიიდან 7 წარმატებით შეიკრიბა ერთ კონტიგად და 3 შეიკრიბა ოთხ ან ნაკლებ კონტიგად.
4. სახამებელი შემდგომში გამოყენებული იყო განავლის ნიმუშებზე, რომლებმაც წარმოიქმნა 20 ცირკულირებული გენომი, მათ შორის Prevotella copri და კანდიდატი Cibiobacter sp., რომლებიც ცნობილია მობილური გენეტიკური ელემენტებით მდიდარი.
მთავარი მიღწევა
ექსტრაქციის პროტოკოლი HWM დნმ-ისთვის
დიდხანს წაკითხული თანმიმდევრობით დაფუძნებული ნაწლავის მეტაგენომიური კვლევები დიდი ხანია განიცდიდა სიმტკიცეს განავლიდან მაღალი მოლეკულური წონის (HMW) დნმ-ის ამოღებისას.ამ კვლევაში შემოღებულ იქნა ფერმენტზე დაფუძნებული ექსტრაქციის პროტოკოლი, რათა თავიდან იქნას აცილებული ვრცელი ცურვა მძივების ცემით ტრადიციულ მეთოდებში.როგორც ნაჩვენებია შემდეგ სურათზე, ნიმუშები პირველად დამუშავდა ფერმენტების კოქტეილით, მათ შორის ლიტური ფერმენტი, მეტაპოლიზიმი და ა.შ. უჯრედის კედლების დასაშლელად.გამოთავისუფლებული დნმ ამოღებულია ფენოლ-ქლოროფორმის სისტემით, რასაც მოჰყვა პროტეინაზა K და RNase A მონელება, სვეტზე დაფუძნებული გაწმენდა და SPRI ზომის შერჩევა.ამ მეთოდმა მოახერხა HMW დნმ-ის მიკროგრამების გამომუშავება 300 მ განავლისგან, რომელიც აკმაყოფილებს ხანგრძლივად წაკითხულ თანმიმდევრობის მოთხოვნებს როგორც ხარისხის, ასევე რაოდენობის თვალსაზრისით.
სურათი 1. HWM დნმ-ის ექსტრაქციის სქემა
ხახის ნაკადის სქემა
როგორც შემდეგ ფიგურაშია აღწერილი, Lathe შეიცავს გუპის გამოყენებით ნედლეულის ბაზის გამოძახების პროცესს.შემდეგ ორ ხანგრძლივად წაკითხულ ასამბლეას აწარმოებენ Flye და Canu ცალ-ცალკე, რასაც მოჰყვება არასწორი შეკრების აღმოჩენა და ამოღება.ორი ქვეასამბლეა გაერთიანებულია სწრაფი შერწყმით.შერწყმისას, მეგაბაზის დონეზე დიდი შეკრებები მოწმდება ცირკულარიზაციაზე.შემდგომში, ამ შეკრებებზე კონსენსუსის დახვეწა მუშავდება მოკლე წაკითხვით.საბოლოო აწყობილი ბაქტერიული გენომები მუშავდება საბოლოო არასწორი შეკრების აღმოსაჩენად და მოსაშორებლად.
ნახაზი 2. Lathe ასამბლეის სქემა
კრახის შეფასება იმიტირებული ბაქტერიების ნარევით
სტანდარტული ATCC 12-სახეობის ნარევი, რომელიც შეიცავდა როგორც გრამდადებით, ასევე გრამუარყოფით ბაქტერიებს, გამოყენებული იყო ნანოფორების თანმიმდევრობის პლატფორმისა და ლათმის მუშაობის შესაფასებლად MAG ასამბლეაში.სულ 30.3 გბ მონაცემები გენერირებული იყო ნანოპური პლატფორმის N50 5.9 კბ.Lathe-მა მნიშვნელოვნად გააუმჯობესა აწყობა N50-მდე 1.6-დან 4-ჯერ შედარებით სხვა დიდი ხნის წაკითხული ასამბლეის ხელსაწყოებთან შედარებით და 2-დან 9-ჯერ შედარებით ჰიბრიდული აწყობის ხელსაწყოებთან შედარებით.12 ბაქტერიული გენომიდან შვიდი შეიკრიბა ერთ კონტიგად (სურათი 3. ცირკი შავი წერტილით).კიდევ სამი შეიკრიბა ოთხ ან ნაკლებ კონტიგად, რომლებშიც ყველაზე არასრული შეკრება შეიცავდა გენომის 83%-ს ერთ კონტიგში.
სურათი 3. გენომის შეკრებები განსაზღვრულ 12-სახეობის ბაქტერიულ ნარევში
ლატის გამოყენება განავლის ნიმუშებში
ეს მეთოდი შემდგომში იქნა გამოყენებული ადამიანის განავლის ნიმუშებზე, რათა შევადაროთ ორგანიზმის იდენტიფიკაცია და შეკრების მიმდებარეობა არსებულ მეთოდებთან, წაკითხვის ღრუბელზე და მოკლე წაკითხვაზე დაფუძნებულ ანალიზთან.ჩართული სამი ნიმუშიდან, ფერმენტზე დაფუძნებულმა ახალმა ექსტრაქციამ გამოიღო მინიმუმ 1 მკგ 300 მგ შეყვანის მასაზე.ამ HMW დნმ-ის ნანოპორების თანმიმდევრობამ წარმოქმნა გრძელვადიანი წაკითხვები N50-ით 4.7 კბ, 3.0 კბ და 3.0 კბ შესაბამისად.აღსანიშნავია, რომ ამ მეთოდმა აჩვენა დიდი პოტენციალი მიკრობების გამოვლენაში არსებულ მეთოდებთან შედარებით.შედარებით მაღალი სახეობის დონის ალფა მრავალფეროვნება იყო ნაჩვენები აქ მოკლე წაკითხვისა და წაკითხვის ღრუბელთან შედარებით.უფრო მეტიც, ყველა გვარი მოკლედ წაკითხული ანალიზიდან, თუნდაც ჩვეულებრივ ლიზის რეზისტენტული გრამდადებითი ორგანიზმები, აღდგენილი იქნა ამ მეთოდით.
ნახაზი 4. ალფა მრავალფეროვნება და ტაქსონომიური კომპონენტები განისაზღვრება Nanopore, მოკლე წაკითხვის და წაკითხვის ღრუბლის მეთოდებით
Lathe-მა გამოიღო ბევრად უფრო გრძელი მთლიანი შეკრება N50, ვიდრე მოკლე წაკითხვისა და წაკითხვის ღრუბლის შეკრება, მიუხედავად ნედლეული მონაცემების სამ-ექვსჯერ ნაკლები შეყვანისა.გენომების მონახაზი წარმოიქმნა კონტიგ ბინინგით, რომლის დროსაც ნახაზები კლასიფიცირდება „მაღალი ხარისხის“ ან „ნაწილობრივ“ სისრულის, დაბინძურების, ერთი ასლის ძირითადი გენების და ა.შ. მოკლედ წასაკითხად და წასაკითხად ღრუბელში.
სურათი 5. თითოეული მეთოდის თითო ორგანიზმის შეკრების მიმდებარეობა
უფრო მეტიც, ახლანდელ შეკრების მიდგომას შეუძლია დახურული, წრიული გენომების გამომუშავება.განავლის ნიმუშებში შეიკრიბა რვა მაღალი ხარისხის, ერთჯერადი გენომი და აქედან ხუთმა მიაღწია ზუსტ ცირკულიზაციას.დიდხანს წაკითხულმა მიდგომამ ასევე აჩვენა შთამბეჭდავი უნარი გენომებში განმეორებადი ელემენტების გადაჭრისას.ცირკულირებულიპ. კოპრიგენომი შეიქმნა ამ მიდგომით, რომელიც ცნობილია, რომ შეიცავს მაღალი ხარისხის თანმიმდევრობის განმეორებას.ამ გენომის საუკეთესო შეკრება მოკლე წაკითხვისა და წაკითხვის ღრუბლის საშუალებით არასოდეს აღემატებოდა N50 130 კბ-ს, თუნდაც დაფარვის სიღრმე 4800X.ეს მაღალი ასლების რაოდენობის ელემენტები სრულად იქნა გადაწყვეტილი ხანგრძლივი წაკითხვის მიდგომით, რომელიც ხშირად გვხვდება მოკლე წაკითხვის ან წაკითხვის ღრუბლის შეკრების წერტილებში.ამ კვლევაში დაფიქსირდა კიდევ ერთი დახურული გენომი, რომელიც ითვლებოდა, რომ ახლახან აღწერილი წევრი იყოციბიობაქტერიკლადი.ამ დახურულ შეკრებაში იდენტიფიცირებული იყო ხუთი სავარაუდო ფაგი, 8.5-დან 65.9 კბ-მდე.
სურათი 6. P.copri-ისა და Cibiobacter sp-ის დახურული გენომის ცირკის დიაგრამა.
მითითება
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).სრული, დახურული ბაქტერიული გენომები მიკრობიომებიდან ნანოფორების თანმიმდევრობის გამოყენებით.ბუნების ბიოტექნოლოგია,38(6), 701-707 წწ.
ტექნიკური და მაჩვენებლები მიზნად ისახავს სხვადასხვა მაღალი გამტარუნარიანობის თანმიმდევრობის ტექნოლოგიების უახლესი წარმატებული გამოყენების გაზიარებას სხვადასხვა კვლევის ასპარეზზე, ასევე ბრწყინვალე იდეების ექსპერიმენტულ დიზაინსა და მონაცემთა მოპოვებაში.
გამოქვეყნების დრო: იან-07-2022