METAGENOMI
Genom bakteria yang lengkap dan tertutup daripada mikrobiom menggunakan penjujukan nanopori
Penjujukan Nanopore |Metagenomik |MAGS |Pekeliling genom bakteria |Mikrobiota usus
Sorotan
1. Kaedah baru untuk mengekstrak serpihan panjang DNA telah dibentangkan dalam kajian ini, yang mencapai pengekstrakan mikrogram DNA HMW tulen yang sesuai untuk penjujukan bacaan lama daripada 300 mg najis
2. Aliran kerja pemasangan, Pelarik, telah diperkenalkan dalam kajian ini, di mana MAG dipasang dengan bacaan panjang dan diperbetulkan dengan bacaan pendek.
3. Pelarik dinilai dengan campuran olok-olok.7 daripada 12 bakteria berjaya dihimpunkan menjadi kontig tunggal dan 3 dihimpun menjadi empat atau kurang kontig.
4. Pelarik selanjutnya digunakan pada sampel najis, yang menghasilkan 20 genom yang dikelilingi, termasuk Prevotella copri dan calon Cibiobacter sp., yang terkenal kerana kaya dengan unsur genetik mudah alih.
Pencapaian Utama
Protokol pengekstrakan untuk DNA HWM
Kajian metagenomik usus berasaskan jujukan panjang telah lama mengalami kekerasan dalam mengekstrak DNA berat molekul tinggi(HMW) daripada najis.Dalam kajian ini, protokol pengekstrakan berasaskan enzim telah diperkenalkan untuk mengelakkan ricih yang meluas dengan pukulan manik dalam kaedah tradisional.Seperti yang ditunjukkan dalam rajah berikut, sampel mula-mula dirawat dengan koktel enzim, termasuk enzim litik, MetaPolyzyme, dll. untuk merendahkan dinding sel.DNA yang dikeluarkan telah diekstrak oleh sistem Phenol-chloroform, diikuti oleh pencernaan Proteinase K dan RNase A, penulenan berasaskan lajur dan pemilihan saiz SPRI.Kaedah ini berjaya menghasilkan mikrogram DNA HMW daripada 300 m najis, yang memenuhi keperluan penjujukan yang dibaca lama dari segi kualiti dan kuantiti.
Rajah 1. Skim pengekstrakan DNA HWM
Skim aliran Pelarik
Seperti yang diterangkan dalam rajah berikut, Lathe mengandungi proses sedia ada proses panggilan asas mentah menggunakan Guppy.Dua himpunan yang dibaca lama kemudian dihasilkan oleh Flye dan Canu secara berasingan diikuti dengan pengesanan dan pengalihan salah pemasangan.Kedua-dua sub-himpunan digabungkan dengan quickmerge.Selepas penggabungan, perhimpunan besar pada tahap megabase kemudiannya diperiksa untuk pekeliling.Selepas itu, penghalusan konsensus pada perhimpunan ini diproses dengan bacaan pendek.Genom bakteria yang dipasang terakhir diproses untuk pengesanan dan penyingkiran salah pemasangan terakhir.
Rajah 2. Aliran skema pemasangan Pelarik
Penilaian Pelarik dengan campuran bakteria olok-olok
Campuran standard ATCC 12 spesies yang terdiri daripada bakteria Gram-positif dan Gram-negatif telah digunakan untuk menilai prestasi platform penjujukan nanopori dan Pelarik dalam pemasangan MAG.Sebanyak 30.3 Gb data telah dijana oleh platform nanopore dengan N50 sebanyak 5.9 kb.Pelarik sebahagian besarnya meningkatkan pemasangan N50 kepada 1.6 hingga 4 kali ganda berbanding alat pemasangan lain yang dibaca lama dan 2 hingga 9 kali ganda berbanding alat pemasangan hibrid.Daripada 12 genom bakteria, tujuh telah dipasang menjadi contigs tunggal (Rajah 3. Circos dengan titik hitam).Tiga lagi telah dipasang ke dalam empat atau kurang contigs, di mana pemasangan paling tidak lengkap mengandungi 83% genom dalam satu contig.
Rajah 3. Himpunan genom dalam campuran bakteria 12 spesies yang ditentukan
Penggunaan Pelarik dalam sampel najis
Kaedah ini selanjutnya digunakan pada sampel najis manusia untuk membandingkan pengenalpastian organisma dan keterkaitan pemasangan dengan kaedah sedia ada, analisis berasaskan awan baca dan bacaan pendek.Daripada tiga sampel yang terlibat, pengekstrakan berasaskan enzim baru menghasilkan sekurang-kurangnya 1 μg setiap 300 mg jisim input.Penjujukan nanopori DNA HMW ini menghasilkan bacaan panjang dengan N50 masing-masing sebanyak 4.7 kb, 3.0kb dan 3.0kb.Terutama, kaedah sekarang menunjukkan potensi besar dalam pengesanan mikrob berbanding kaedah sedia ada.Kepelbagaian alfa peringkat spesies yang agak tinggi ditunjukkan di sini berbanding dengan bacaan pendek dan awan baca.Selain itu, semua genera daripada analisis bacaan pendek, walaupun biasanya organisma Gram-positif yang tahan lisis, telah dipulihkan dengan kaedah ini.
Rajah 4. Kepelbagaian alfa dan komponen taksonomi ditentukan oleh Nanopore, kaedah baca pendek dan awan baca
Pelarik menghasilkan lebih lama pemasangan keseluruhan N50 daripada pemasangan bacaan pendek dan awan baca, walaupun input data mentah tiga hingga enam kali ganda lebih rendah.Draf genom dihasilkan oleh contig binning, di mana draf dikelaskan kepada "berkualiti tinggi" atau "separa" berdasarkan kesempurnaan, pencemaran, gen teras salinan tunggal, dsb. Pemasangan yang dibaca lama menunjukkan keterkaitan yang jauh lebih tinggi pada kos yang lebih rendah berbanding kepada bacaan pendek dan awan baca.
Rajah 5. Keterkaitan pemasangan per-organisma bagi setiap kaedah
Selain itu, pendekatan pemasangan sekarang mampu menghasilkan genom bulat tertutup.Dalam sampel najis, lapan genom tunggal-contig berkualiti tinggi telah dipasang dan lima daripadanya mencapai pekeliling percis.Pendekatan membaca panjang juga menunjukkan kapasiti yang mengagumkan dalam menyelesaikan unsur berulang dalam genom.DiedarkanP. coprigenom dihasilkan oleh pendekatan ini, yang telah diketahui mengandungi pengulangan jujukan tahap tinggi.Himpunan terbaik genom ini dengan bacaan pendek dan awan baca tidak pernah melebihi N50 sebanyak 130 kb, walaupun dengan kedalaman liputan 4800X.Elemen nombor salinan tinggi ini telah diselesaikan sepenuhnya dengan pendekatan baca panjang, yang sering ditemui pada titik putus perhimpunan baca pendek atau awan baca.Satu lagi genom tertutup telah dilaporkan dalam kajian ini, yang dipercayai ahli yang diterangkan baru-baru iniCibiobacterclade.Lima fag putative telah dikenal pasti dalam perhimpunan tertutup ini, antara 8.5 hingga 65.9 kb.
Rajah 6. Diagram Circos bagi genom tertutup P.copri dan Cibiobacter sp.
Rujukan
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Genom bakteria yang lengkap dan tertutup daripada mikrobiom menggunakan penjujukan nanopori.Bioteknologi alam semula jadi,38(6), 701-707.
Teknologi dan Sorotan bertujuan untuk berkongsi aplikasi kejayaan terbaharu bagi teknologi penjujukan pemprosesan tinggi yang berbeza dalam pelbagai arena penyelidikan serta idea bernas dalam reka bentuk eksperimen dan perlombongan data .
Masa siaran: Jan-07-2022