微生物多様性研究における全長アンプリコン配列決定の応用

微生物生態学

農業の強化により微生物ネットワークの複雑さが減少し、根に存在するキーストーン分類群が豊富に存在する

全長アンプリコンシークエンシング (ITS) |パックバイオハイファイ

ハイライト

A農業の集約化は、栄養利用効率の低下、地下水の富栄養化、土壌品質の劣化などを含む環境への悪影響により、ますます問題となっている。悪影響を軽減するために、不耕起農業や有機農業を含む代替農業システムが広く採用されている。微生物群集は、農業生態系の生産性と持続可能性において不可欠な役割を果たしています。しかし、異なる農業システムが根の微生物叢にどのような影響を与えるかはかなり不明瞭です。

実験計画

実験

S油と根（DNA）サンプルは、60 の農地の小麦畑から採取されました（各 20 個）
Gルーピング: 1. コンベンション (耕耘あり);2. 慣例（不耕起）。3. 有機農地
Sシーケンス戦略: 全長アンプリコンシーケンス (ITS)
Pリマー: ITS1F-ITS4 (ITS 領域全体 ~630 bp をターゲット)
Sシーケンスプラットフォーム: PacBio RS II

バイオインフォマティクス分析

結果

Oサイトごとに平均 357 個の OTU が特定され、60 サイトすべてで合計 837 個の OTU が特定されました。根菌群集のアルファ多様性は、3 つの農業システム間で有意な差を示さなかった。しかし、ベータ多様性分析では 3 つの異なるクラスターが形成され、農業システムが根菌群落の構造に強い影響を与えていることが示されました。

図 1. 根菌類群集のアルファ多様性分析 (シャノン指数と群集構成) およびベータ多様性分析 (主座標の正準分析)

Tキーストーン分類群は、3 つの農業システムにわたる菌群集の全体的なネットワークに基づいて定義されました。最高の次数、最高の近接中心性、最低の媒介中心性を持つ上位 10 ノードが選択されました。そのうちの7つは菌根目に属していました。

図 2. 3 つの農業システムの根菌群落の全体的なネットワーク

F警戒システム固有のネットワークは、不耕起ネットワークや従来のネットワークに比べて、2 倍以上のエッジとより多くの接続ノードを備えた有機ネットワークの接続性がかなり高いことを示しました。さらに、有機農業ネットワークには、他のものと比較してはるかに多くのキーストーン分類群（ダイヤモンド）が含まれており、それがその複雑さと接続性を支えていました。

図 3. 農業システム固有の根菌ネットワーク

A農業強度と根菌ネットワークの接続性の間には強い負の相関が観察されました。ランダムフォレスト分析により、キーストーン分類群の主な要因である土壌リン、かさ密度、pH、菌根のコロニー形成が明らかになりました。

図 4. 3 つの農業システム (A および B) にわたる農業強度とネットワーク接続性。ランダムフォレスト分析 (C) および農業強度と AMF 定着との関係 (D)

テクノロジー

全長アンプリコンのシーケンス

A■ 「第 3 世代シーケンシング」の登場により、ターゲット領域の制限やデノボアセンブリの問題は克服されました。Pacific Bioscience (PacBio) は、配列の読み取り範囲を数十キロベースまで拡張することに成功しました。これにより、細菌の 16S rRNA (1,000 bp ～ 1,500 bp) または 18S rRNA (1,500 bp ～ 2,000 bp) および ITS の全長読み取りが可能になります。真核生物の領域 (400 bp ～ 900 bp)。遺伝分野の視野が広がったことで、種の注釈と機能遺伝子の解像度が大幅に向上しました。長年懸念されていた塩基精度の問題は、99% 以上の読み取り精度で HIFI 読み取りを生成する PacBio CCS 自己補正によって解決されました。