ٹرانسکرپٹومکس
فطرت
مواصلات
دائمی لیمفوسائٹک لیوکیمیا میں SF3B1 اتپریورتن کی مکمل لمبائی کی نقل کی خصوصیت برقرار رکھے ہوئے انٹرنز کی کمی کو ظاہر کرتی ہے۔
مکمل طوالت کی نقلیں |نینو پور کی ترتیب |متبادل isoform تجزیہ
پس منظر
Sسپلیسنگ فیکٹر SF3B1 میں اومیٹک اتپریورتنوں کو مختلف کینسروں کے ساتھ منسلک کرنے کی وسیع پیمانے پر اطلاع دی گئی ہے، بشمول دائمی لمفوسائٹک لیوکیمیا (سی ایل ایل)، یوول میلانوما، چھاتی کا کینسر، وغیرہ۔تاہم، ان متبادل الگ کرنے والے نمونوں پر مطالعہ طویل عرصے سے واقعہ کی سطح تک محدود ہے اور مختصر پڑھے جانے والے اسمبل ٹرانسکرپٹس کی محدودیت کی وجہ سے isoform سطح پر علم کی کمی ہے۔یہاں، نینو پور سیکوینسنگ پلیٹ فارم کو مکمل طوالت کی نقلیں تیار کرنے کے لیے متعارف کرایا گیا، جس نے AS isoforms پر تفتیش کو بااختیار بنایا۔
تجرباتی نمونہ
تجربات
گروپ بندی:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E میوٹیشن)؛3. نارمل بی سیلز
ترتیب کی حکمت عملی:MinION 2D لائبریری کی ترتیب، PromethION 1D لائبریری کی ترتیب؛اسی نمونوں سے مختصر پڑھا جانے والا ڈیٹا
ترتیب پلیٹ فارم:او این ٹی منین؛ONT PromethION؛
بایو انفارمیٹک تجزیہ
نتائج
اےکل 257 ملین ریڈز 6 سی ایل ایل نمونوں اور 3 بی سیلز سے تیار کیے گئے۔ان پڑھوں میں سے اوسطاً 30.5% کی شناخت مکمل طوالت کی نقل کے طور پر کی گئی۔
FRNA(FLAIR) کا مکمل طوالت کا متبادل isoform تجزیہ اعلی اعتماد والے isoforms کا ایک سیٹ تیار کرنے کے لیے تیار کیا گیا تھا۔FLAIR کا خلاصہ اس طرح کیا جا سکتا ہے:
Nanopore سیدھ پڑھتا ہے: حوالہ جینوم کی بنیاد پر عام نقل کی ساخت کی شناخت کریں؛
Splice junction تصحیح: درست ترتیب کی غلطیاں (سرخ) اسپلائس سائٹ کے ساتھ یا تو تشریح شدہ انٹرنز سے، مختصر پڑھنے والے ڈیٹا سے انٹرنز یا دونوں سے؛
Collapse: splice junction chains (پہلے پاس سیٹ) پر مبنی نمائندہ آئسفارمز کا خلاصہ کریں۔سپورٹنگ ریڈز کی تعداد (تھریش ہولڈ: 3) کی بنیاد پر ہائی پراعتماد isofrom کا انتخاب کریں۔
شکل 1. CLL میں SF3B1 اتپریورتن سے وابستہ مکمل لینتھ آئسفارمز کی شناخت کے لیے FLAIR تجزیہ
FLAIR نے 326,699 اعلیٰ اعتماد کے کٹے ہوئے آئسفارمز کی نشاندہی کی، جن میں سے 90% نوول آئسوفارمز ہیں۔ان میں سے زیادہ تر غیر تشریح شدہ آئسفارمز مشہور اسپلائس جنشنز (142,971) کے ناول امتزاج کے طور پر پائے گئے، جبکہ باقی نوول آئسوفارمز میں یا تو برقرار رکھا ہوا انٹرن (21,700) یا ناول ایکسون (3594) تھا۔
Long-read sequences isoform-level پر اتپریورتی SF3B1-K700E -تبدیل شدہ اسپلائس سائٹس کی شناخت کو تقویت دیتا ہے۔35 متبادل 3'SSs اور 10 متبادل 5'SSs SF3B1-K700E اور SF3B1-WT کے درمیان نمایاں طور پر الگ الگ پائے گئے۔35 میں سے 33 تبدیلیاں طویل پڑھے جانے والے تسلسل کے ذریعہ نئی دریافت کی گئیں۔نانوپور ڈیٹا میں، SF3B1-K700E-تبدیل شدہ 3'SSs کے درمیان کیننیکل سائٹس چوٹیوں کے درمیان فاصلے کی تقسیم -20 bp کے لگ بھگ ہے، جو کہ کنٹرول ڈسٹری بیوشن سے نمایاں طور پر مختلف ہے، جیسا کہ CLL مختصر پڑھنے کے سلسلے میں رپورٹ کیا گیا ہے۔ERGIC3 جین کے آئسفارمز کا تجزیہ کیا گیا، جہاں SF3B1-K700E میں قربت والی جگہ پر مشتمل ایک ناول آئسوفارم زیادہ پایا گیا۔قریبی اور ڈسٹل 3'SS دونوں الگ الگ AS پیٹرن کے ساتھ وابستہ تھے جو ایک سے زیادہ isoforms پیدا کرتے ہیں۔
شکل 2. متبادل 3′ الگ کرنے والے نمونوں کی شناخت نینو پور کی ترتیب کے اعداد و شمار کے ساتھ
IR کی شناخت اور مقدار میں اعتماد کی وجہ سے IR ایونٹ کے استعمال کا تجزیہ مختصر پڑھنے پر مبنی تجزیہ میں طویل عرصے سے محدود ہے۔SF3B1-K700E اور SF3B1-WT میں IR isoforms کے اظہار کی مقدار نینو پور کی ترتیب کی بنیاد پر طے کی گئی تھی، جس سے SF3B1-K700E میں IR isoforms کے عالمی سطح پر ڈاؤن ریگولیشن کا پتہ چلتا ہے۔
شکل 4. زراعت کی شدت اور تین کاشتکاری کے نظاموں میں نیٹ ورک کنیکٹوٹی (A اور B)؛جنگل کا بے ترتیب تجزیہ (C) اور زرعی شدت اور AMF کالونائزیشن (D) کے درمیان تعلق
شکل 3. CLL SF3B1-K700E میں انٹرن رینٹینشن ایونٹس کو زیادہ مضبوطی سے کم کیا گیا ہے۔
ٹیکنالوجی
نانوپور لانگ ریڈ سیکوینسنگ
Nanopore sequencing ایک واحد مالیکیول ریئل ٹائم الیکٹریکل سگنل سیکوینسنگ ٹیکنالوجی ہے۔
Double-stranded DNA یا RNA بائیو فلم میں سرایت شدہ نینو پورس پروٹین کے ساتھ جڑے ہوں گے اور موٹر پروٹین کی قیادت میں کھولے جائیں گے۔
DNA/RNA اسٹرینڈز وولٹیج فرق کے عمل کے تحت مخصوص شرح پر نینو پور چینل پروٹین سے گزرتے ہیں۔
Molecules کیمیائی ساخت کے مطابق مختلف برقی سگنل پیدا کرتے ہیں۔
Rترتیب کی ابتدائی وقت کا پتہ لگانا بیس کالنگ کے ذریعے حاصل کیا جاتا ہے۔
مکمل طوالت کے ٹرانسکرپٹوم کی ترتیب کی کارکردگی
√ ڈیٹا سیچوریشن
موازنہ ڈیٹا سیچوریشن تک پہنچنے کے لیے 7 گنا کم پڑھنے کی ضرورت ہے۔
√ نقل کی ساخت کی شناخت
ہر ٹرانسکرپٹ کے متفقہ مکمل طوالت کے پڑھنے کے ساتھ متنوع ساختی تغیرات کی شناخت
√ ٹرانسکرپٹ کی سطح کا تفریق تجزیہ - مختصر پڑھنے سے چھپی تبدیلیوں کو ظاہر کریں۔
حوالہ
تانگ AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.دائمی لیمفوسائٹک لیوکیمیا میں SF3B1 اتپریورتن کی مکمل لمبائی کی نقل کی خصوصیت برقرار رکھے ہوئے introns [J] کی کمی کو ظاہر کرتی ہے۔نیچر کمیونیکیشنز۔
ٹیک اور ہائی لائٹس جس کا مقصد مختلف تحقیقی میدانوں میں مختلف ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کے حالیہ کامیاب اطلاق کے ساتھ ساتھ تجرباتی ڈیزائن اور ڈیٹا مائننگ میں شاندار خیالات کا اشتراک کرنا ہے۔
پوسٹ ٹائم: جنوری 08-2022