TRANSKRIPTOMIKO
naturo
KOMUNIKOJ
Plenlonga transskriba karakterizado de SF3B1-mutacio en kronika limfocita leŭkemio rivelas subreguligo de retenitaj introj
Plenlongaj transskribaĵoj|Nanopora sekvencado|Alternativa izoforma analizo
Fono
SOmataj mutacioj en splisanta faktoro SF3B1 estis vaste raportitaj asocii kun diversaj kanceroj, inkluzive de kronika limfocita leŭkemio (CLL), uvea melanomo, mama kancero, ktp. Krome, mallonglegitaj transcriptomic-studoj rivelis aberantajn splisadpadronojn induktitajn de SF3B1-mutacioj.Tamen, studoj pri tiuj alternativaj splisadpadronoj longe estis limigitaj al okazaĵ-nivelo kaj manko de scio sur izoform-nivelo pro la limigo de mallonglegataj kunvenitaj transskribaĵoj.Ĉi tie, nanopora sekvenca platformo estis lanĉita por generi plenlongajn transskribaĵojn, kiuj rajtigis inversigon sur AS-izoformoj.
Eksperimenta Dezajno
Eksperimentoj
Grupiĝo:1. CLL-SF3B1 (WT) 2. CLL-SF3B1 (K700E mutacio);3. Normalaj B-ĉeloj
Sekvenca strategio:MinION 2D-biblioteksekvencado, PromethION 1D-biblioteksekvencado;mallonglegeblaj datumoj de samaj specimenoj
Sekvenca platformo:ONT Minion;ONT PromethION;
Bioinformatika Analizo
Rezulto
Atotalo de 257 milionoj da legaĵoj estis generita de 6 CLL-provaĵoj kaj 3 B-ĉeloj.Averaĝe 30.5% de ĉi tiuj legaĵoj estis identigitaj kiel plenlongaj transskribaĵoj.
FTut-longa alternativa izoformanalizo de RNA (FLAIR) estis evoluigita por generi aron de alt-fidaj izoformoj.FLAIR povas esti resumita kiel:
Nanopore legas vicigon: identigu ĝeneralan transskriba strukturon bazitan sur referenca genaro;
Splice-junkcia korekto: korekta sekvencaj eraroj (ruĝa) kun splisa ejo de aŭ komentitaj intronoj, intronoj de mallonglegadaj datumoj aŭ ambaŭ;
Collapse: resumu reprezentajn izoformojn bazitajn sur splisaj krucvojĉenoj (unua-pasa aro).Elektu altan konfidon de surbaze de nombro da subtenaj legaĵoj (Sojlo: 3).
Figuro 1. FLAIR-analizo por identigi plenlongajn izoformojn asociitajn kun SF3B1-mutacio en CLL
FLAIR Identigis 326,699 altkonfidajn splisitajn izoformojn, 90% el kiuj estas novaj izoformoj.La plej multaj el tiuj nekontitaj izoformoj estis trovitaj esti novaj kombinaĵoj de konataj splisaj krucvojoj (142,971), dum la ceteraj novaj izoformoj enhavis aŭ retenitan intronon (21,700) aŭ novan ekson (3594).
Long-legeblaj sekvencoj ebligas identigon de mutaciulo SF3B1-K700E-ŝanĝitaj splisejoj ĉe izoform-nivelo.35 alternativaj 3'SS kaj 10 alternativaj 5'SS estis trovitaj esti signife diferencige splisitaj inter SF3B1-K700E kaj SF3B1-WT.33 el la 35 ŝanĝoj estis lastatempe malkovritaj per longlegitaj sekvencoj.En Nanopore-datenoj, la distribuado de distanco inter SF3B1-K700E-ŝanĝitaj 3'SS al kanonikaj ejoj-pintoj estas proksimume -20 bp, kiu estas signife deviis de kontroldistribuo, simila al kio estis raportita en CLL-mallonglegaj sekvencoj.Izoformoj de ERGIC3-geno estis analizitaj, kie nova izoformo enhavanta la proksimalan splisejon estis trovita pli abunda en SF3B1-K700E.Kaj proksimala kaj distala 3'SS estis asociitaj kun distingitaj AS-padronoj generantaj multoblajn izoformojn.
Figuro 2. Alternativaj 3′ splisaj ŝablonoj identigitaj kun nanoporaj sekvencaj datumoj
IR-okazaĵuzanalizo estis longe limigita en mallonglega analizo pro fido je IR-identigo kaj kvantigo.Esprimo de IR-izoformoj en SF3B1-K700E kaj SF3B1-WT estis kvantigita surbaze de nanoporsekvencoj, rivelante tutmondan malsupren-reguligon de IR-izoformoj en SF3B1-K700E.
Figuro 4. Agrikultura intenseco kaj reto-konekteco tra tri agrikulturaj sistemoj (A kaj B);Hazarda arbaranalizo (C) kaj Rilato inter agrikultura intenseco kaj AMF-koloniigo (D)
Figuro 3. Intron-retenaj eventoj estas pli forte subreguligitaj en CLL SF3B1-K700E
Teknologio
Nanopore Long-lega Sekvencado
Nanoporsekvencado estas ununura molekulo realtempa elektra signalsekvenca teknologio.
Dduble-senhelpa DNA aŭ RNA ligos al nanopora proteino enigita en la biofilmo kaj malvolviĝanta sub la gvido de motorproteino.
DNA/RNA-fadenoj pasas tra nanopora kanalproteino kun certa rapideco sub la ago de tensiodiferenco.
Molekuloj generas malsamajn elektrajn signalojn laŭ kemia strukturo.
Raltempa detekto de sekvencoj estas atingita per bazvoko.
Efikeco de plenlonga transkriptomsekvencado
√ Datumsaturiĝo
7-oble malpli da legaĵoj necesaj por atingi komparebla datuma saturiĝo.
√ Transskriba Strukturo Identigo
Identigo de diversaj strukturaj variantoj kun konsenta plenlonga legado de ĉiu transskribaĵo
√ Transskriba-nivela diferenciga analizo - Malkaŝu ŝanĝojn kaŝitajn de mallongaj legadoj
Referenco
Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Plenlonga transskriba karakterizado de SF3B1-mutacio en kronika limfocita leŭkemio rivelas subreguligo de retenitaj intronoj [J].Naturkomunikadoj.
Tekniko kaj Kulminaĵoj celas kunhavigi plej lastatempan sukcesan aplikon de malsamaj alt-trafikaj sekvencaj teknologioj en diversaj esplorkampoj same kiel brilajn ideojn en eksperimenta dezajno kaj datumminado.
Afiŝtempo: Jan-08-2022