النسخ
طبيعة
مجال الاتصالات
يكشف توصيف النسخة الكاملة لطفرة SF3B1 في سرطان الدم الليمفاوي المزمن عن تقليل تنظيم الإنترونات المحتجزة
النصوص الكاملة |تسلسل ثقب النانو|التحليل الإسوي البديل
خلفية
Sتم الإبلاغ على نطاق واسع عن الطفرات الأرومية في عامل الربط SF3B1 لارتباطها بالعديد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)، وسرطان الجلد العنبي، وسرطان الثدي، وما إلى ذلك. بالإضافة إلى ذلك، كشفت الدراسات النصية القصيرة القراءة عن أنماط الربط الشاذة الناجمة عن طفرات SF3B1.ومع ذلك، فإن الدراسات حول أنماط الربط البديلة هذه اقتصرت منذ فترة طويلة على مستوى الحدث ونقص المعرفة على مستوى الشكل الإسوي بسبب محدودية النصوص المجمعة قصيرة القراءة.هنا، تم تقديم منصة تسلسل ثقب النانو لإنشاء نصوص كاملة الطول، مما مكّن من البحث في الأشكال الإسوية AS.
تصميم تجريبي
التجارب
التجميع:1. CLL-SF3B1 (WT) 2. CLL-SF3B1 (طفرة K700E)؛3. الخلايا البائية الطبيعية
استراتيجية التسلسل:تسلسل مكتبة MinION 2D، وتسلسل مكتبة PromethION 1D؛بيانات قصيرة القراءة من نفس العينات
منصة التسلسل:أونت مينيون؛أونت بروميثيون؛
تحليل المعلومات الحيوية
نتائج
أتم إنشاء إجمالي 257 مليون قراءة من 6 عينات من CLL و3 خلايا B.تم تحديد 30.5% من هذه القراءات في المتوسط على أنها نصوص كاملة الطول.
Fتم تطوير تحليل إسوي بديل كامل الطول لـ RNA (FLAIR) لإنشاء مجموعة من الأشكال الإسوية عالية الثقة.يمكن تلخيص FLAIR على النحو التالي:
Nيقرأ Anopore المحاذاة: تحديد بنية النص العامة بناءً على الجينوم المرجعي؛
Sتصحيح تقاطع الوصلة: أخطاء التسلسل الصحيحة (باللون الأحمر) مع موقع الوصلة من الإنترونات المشروحة، أو الإنترونات من البيانات قصيرة القراءة أو كليهما؛
Collapse: تلخيص الأشكال الإسوية التمثيلية بناءً على سلاسل الوصلات الوصلية (مجموعة التمرير الأول).حدد isofrom عالي الثقة بناءً على عدد القراءات الداعمة (العتبة: 3).
الشكل 1. تحليل FLAIR لتحديد الأشكال الإسوية الكاملة المرتبطة بطفرة SF3B1 في CLL
Fحددت LAIR 326,699 من الأشكال الإسوية المقسمة عالية الثقة، 90% منها عبارة عن أشكال إسوية جديدة.تم العثور على معظم هذه الأشكال الإسوية غير المشروحة على أنها مجموعات جديدة من وصلات الوصلات المعروفة (142,971)، في حين أن بقية الأشكال الإسوية الجديدة تحتوي إما على إنترون محتجز (21,700) أو إكسون جديد (3594).
Lتُمكّن تسلسلات القراءة الطويلة من تحديد مواقع الوصلات المتغيرة SF3B1-K700E على مستوى الشكل الإسوي.تم العثور على 35 بديل 3'SSs و10 بدائل 5'SSs مقسمة بشكل تفاضلي كبير بين SF3B1-K700E وSF3B1-WT.تم اكتشاف 33 من التعديلات الـ 35 حديثًا من خلال تسلسلات طويلة القراءة.في بيانات Nanopore، يبلغ توزيع المسافة بين 3'SSs التي تم تغييرها SF3B1-K700E إلى قمم المواقع الأساسية حوالي -20 نقطة أساس، وهو ما يختلف بشكل كبير عن توزيع التحكم، على غرار ما تم الإبلاغ عنه في تسلسلات القراءة القصيرة CLL.تم تحليل الأشكال الإسوية لجين ERGIC3، حيث تم العثور على شكل إسوي جديد يحتوي على موقع الوصلة القريبة أكثر وفرة في SF3B1-K700E.ارتبط كل من 3'SS القريب والبعيد بأنماط AS المميزة التي تولد أشكالًا إسوية متعددة.
الشكل 2. أنماط الربط البديلة 3 التي تم تحديدها باستخدام بيانات تسلسل ثقب النانو
لقد كان تحليل استخدام حدث الأشعة تحت الحمراء محدودًا لفترة طويلة في التحليل القائم على القراءة القصيرة بسبب الثقة في تحديد الأشعة تحت الحمراء وتقديرها الكمي.تم قياس كمية التعبير عن الأشكال الإسوية للأشعة تحت الحمراء في SF3B1-K700E وSF3B1-WT بناءً على تسلسلات النانو، مما يكشف عن التنظيم العالمي للأشكال الإسوية للأشعة تحت الحمراء في SF3B1-K700E.
الشكل 4. كثافة الزراعة واتصال الشبكات عبر ثلاثة أنظمة زراعية (أ وب)؛التحليل العشوائي للغابات (C) والعلاقة بين الكثافة الزراعية واستعمار AMF (D)
الشكل 3. يتم تنظيم أحداث استئجار Intron بقوة أكبر في CLL SF3B1-K700E
تكنولوجيا
Nanopore تسلسل القراءة الطويلة
Nتسلسل Anopore عبارة عن تقنية تسلسل الإشارات الكهربائية في الوقت الفعلي لجزيء واحد.
Dسوف يرتبط الحمض النووي الريبي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA) المزدوج الجديلة بالبروتين النانوي المضمن في الأغشية الحيوية ويتم فكه تحت قيادة البروتين الحركي.
Dتمر خيوط NA/RNA عبر بروتين قناة ثقب النانو بمعدل معين تحت تأثير فرق الجهد.
Mتولد الجزيئات إشارات كهربائية مختلفة وفقًا للتركيب الكيميائي.
Rيتم تحقيق الكشف عن التسلسلات في الوقت الحقيقي عن طريق الاتصال الأساسي.
أداء تسلسل النسخ كامل الطول
√ تشبع البيانات
مطلوب قراءات أقل بمقدار 7 أضعاف للوصول إلى تشبع البيانات القابل للمقارنة.
√ تحديد هيكل النص
تحديد المتغيرات الهيكلية المتنوعة مع قراءات كاملة بالإجماع لكل نسخة
√ التحليل التفاضلي على مستوى النص - كشف التغييرات المخفية بواسطة القراءات القصيرة
مرجع
تانغ أد، سوليت سم، بارين إم جي في، وآخرون.يكشف توصيف النسخة الكاملة لطفرة SF3B1 في سرطان الدم الليمفاوي المزمن عن تقليل تنظيم الإنترونات المحتجزة [J].اتصالات الطبيعة.
التكنولوجيا ويسلط الضوء يهدف إلى مشاركة أحدث التطبيقات الناجحة لمختلف تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية في مختلف مجالات البحث بالإضافة إلى الأفكار الرائعة في التصميم التجريبي واستخراج البيانات.
وقت النشر: 08 يناير 2022