ТРАНСКРИПТОМИКА
природа
КОМУНИКАЦИЈЕ
Карактеризација транскрипта пуне дужине мутације СФ3Б1 код хроничне лимфоцитне леукемије открива смањење регулације задржаних интрона
Транскрипти у пуној дужини|Секвенцирање нанопора|Алтернативна анализа изоформе
Позадина
SЗа оматске мутације у фактору спајања СФ3Б1 се нашироко наводи да се повезују са различитим врстама рака, укључујући хроничну лимфоцитну леукемију (ЦЛЛ), увеални меланом, рак дојке, итд. Поред тога, кратко читане транскриптомске студије су откриле аберантне обрасце спајања изазване мутацијама СФ3Б1.Међутим, студије о овим алтернативним обрасцима спајања су дуго биле ограничене на ниво догађаја и недостатак знања о нивоу изоформе због ограничења састављених транскрипата који се кратко читају.Овде је уведена платформа за секвенцирање нанопора да би се генерисали транскрипти пуне дужине, што је омогућило истрагу АС изоформа.
Експериментални дизајн
Експерименти
Груписање:1. ЦЛЛ-СФ3Б1(ВТ) 2. ЦЛЛ-СФ3Б1(К700Е мутација);3. Нормалне Б-ћелије
Стратегија секвенцирања:МинИОН 2Д секвенцирање библиотеке, ПрометхИОН 1Д секвенцирање библиотеке;кратко прочитани подаци из истих узорака
Платформа секвенцирања:ОНТ МинИОН;ОНТ ПрометхИОН;
Биоинформатичка анализа
Резултати
Аукупно 257 милиона читања је генерисано из 6 узорака ЦЛЛ и 3 Б-ћелије.У просеку 30,5% ових читања идентификовано је као транскрипти пуне дужине.
FАлтернативна анализа изоформе велике дужине РНК (ФЛАИР) је развијена да генерише скуп изоформа високе поузданости.ФЛАИР се може резимирати као:
Nанопоре реадс алигнмент: идентификовати општу структуру транскрипта на основу референтног генома;
Sкорекција споја плице: исправити грешке секвенце (црвено) са местом спајања било од анотираних интрона, интрона из података кратког читања или обоје;
Cоллапсе: сумирајте репрезентативне изоформе засноване на ланцима спојних спојева (сет за први пролаз).Изаберите исофом високе поузданости на основу броја пратећих читања (праг: 3).
Слика 1. ФЛАИР анализа за идентификацију изоформа пуне дужине повезаних са мутацијом СФ3Б1 у ЦЛЛ
FЛАИР је идентификовао 326,699 високопоузданих спојених изоформа, од којих су 90% нове изоформе.Утврђено је да су већина ових ненаглашених изоформа нове комбинације познатих спојева (142,971), док су остале нове изоформе садржавале или задржани интрон (21,700) или нови егзон (3594).
Lдуго читане секвенце омогућавају идентификацију мутантних СФ3Б1-К700Е -измењених места спајања на нивоу изоформе.Утврђено је да су 35 алтернативних 3'СС и 10 алтернативних 5'СС значајно различито спојени између СФ3Б1-К700Е и СФ3Б1-ВТ.33 од 35 измена су недавно откривене дуго читаним секвенцама.У Нанопоре подацима, дистрибуција удаљености између СФ3Б1-К700Е-измењених 3'СС-ова до врхова канонских места је око -20 бп, што се значајно разликује од контролне дистрибуције, слично ономе што је пријављено у секвенцама кратког читања ЦЛЛ-а.Анализиране су изоформе гена ЕРГИЦ3, где је нова изоформа која садржи проксимално место спајања нађена у већој количини у СФ3Б1-К700Е.И проксимални и дистални 3'СС били су повезани са различитим АС обрасцима који су генерисали више изоформа.
Слика 2. Алтернативни 3′ обрасци спајања идентификовани са подацима секвенцирања нанопора
Анализа употребе ИР догађаја је дуго била ограничена у анализи заснованој на кратком читању због поверења у ИР идентификацију и квантификацију.Експресија ИР изоформа у СФ3Б1-К700Е и СФ3Б1-ВТ квантификована је на основу секвенци нанопора, откривајући глобалну смањење ИР изоформа у СФ3Б1-К700Е.
Слика 4. Интензитет пољопривреде и мрежна повезаност у три пољопривредна система (А и Б);Анализа случајних шума (Ц) и Однос између интензитета пољопривреде и колонизације АМФ (Д)
Слика 3. Догађаји рентенције интрона су снажније регулисани у ЦЛЛ СФ3Б1-К700Е
Технологија
Нанопоре Лонг-реад Секуенцинг
Nанопоре секвенцирање је технологија секвенцирања електричног сигнала у реалном времену са једним молекулом.
Dдволанчана ДНК или РНК ће се везати за нанопорозни протеин уграђен у биофилм и одмотати се под вођством моторног протеина.
DНА/РНА ланци пролазе кроз протеин нанопоре канала одређеном брзином под дејством разлике напона.
Mолекуле генеришу различите електричне сигнале према хемијској структури.
Rеал-тиме детекција секвенци се постиже позивањем базе.
Извођење секвенцирања транскриптома пуне дужине
√ Засићеност података
Потребно је 7 пута мање читања да би се постигла упоредива засићеност подацима.
√ Идентификација структуре транскрипта
Идентификација различитих структурних варијанти са консензусним читањем у пуној дужини сваког транскрипта
√ Диференцијална анализа на нивоу транскрипта -Откривање промена скривених кратким читањем
Референце
Танг АД, Соулетте ЦМ, Барен МЈВ, ет ал.Карактеризација транскрипта пуне дужине мутације СФ3Б1 код хроничне лимфоцитне леукемије открива смањење регулације задржаних интрона [Ј].Натуре Цоммуницатионс.
Тецх анд Хигхлигхтс има за циљ да подели најновију успешну примену различитих технологија секвенцирања високе пропусности у различитим истраживачким аренама, као и бриљантне идеје у експерименталном дизајну и рударењу података.
Време поста: Јан-08-2022