BÜTÜN GENOMUN YENİDEN DÜZENLENMESİ
SARS-CoV-2'nin genomik izlemesi, tip I interferon yanıtını modüle eden bir Nsp1 delesyon varyantını ortaya çıkarıyor
Nanogözenek |Illumina |Tüm genomun yeniden dizilenmesi |metagenomik |RNA-Sırası |Sanger
Biomarker Technologies bu çalışmada örnek sıralama konusunda teknik destek sağlamıştır.
Öne Çıkanlar
1.SARS-CoV-2 genom dizilimi ve filonetik analiz, 31 SNP ve 4 Indel dahil olmak üzere 35 tekrarlayan mutasyonu tanımlar.
2. 117 klinik fenotiple ilişki potansiyel olarak ortaya çıkıyor
önemli mutasyonlar
Nsp1 kodlama bölgesindeki ∆500-532, daha düşük viral düzeylerle ilişkilidir
3.yük ve serum IFN-β.
4. ∆500-532 mutasyonuna sahip viral izolatlar daha düşük IFN-I'e neden olur
enfekte olmuş hücrelerde yanıt.
Deneysel tasarım
Başarılar
1.COVID-19 epidemiyolojik ve genomik sürveyansı
Çin'in Sichuan eyaletinden 22 Ocak 2020 ile 20 Şubat 2020 arasındaki salgın dönemi boyunca klinik veriler toplandı. Sichuan'da %28,8'i eyaletten olmak üzere toplam 538 COVİD-19 vakası qPCR testleri ile doğrulandı. başkent.Sichuan'da doğrulanan vakalar katlanarak arttı ve 30 Ocak'ta zirveye ulaştı.Ayrıca veriler, sosyal mesafenin virüsün yayılmasını önlemede önemli bir faktör olabileceğini destekledi.
Şekil 1. Çin'in Sichuan eyaletindeki COVID-19'un epidemiyolojik çalışması
2. SARS-CoV-2 genom yapısı ve varyantlarının tanımlanması
Multipleks PCR amplifikasyonu ve ardından nano-gözenek dizilimi ile 248 hastadan toplam 310 tama yakın veya kısmi tam genom yaklaşık olarak üretildi.10 okumanın kapsadığı genomların %80'i (Ortalama derinlik: örnek başına 0,39 M okuma).
Şekil 2. Sichuan kohortunda her bir varyantın sıklığı
SARS-CoV-2 genomlarından toplam 104 SNP ve 18 Indel tanımlandı; bunların 31 SNP ve 4 Indel'i tekrarlayan genetik varyantlar olarak tanımlandı.Bunları Wuhan'dan 169 örnekle ve GISAID'deki 81.391 yüksek kaliteli halka açık genom dizisiyle karşılaştırarak, bulunan 35 varyanttan 29'unun diğer kıtalarda sunulduğunu tespit ettik.Özellikle, ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 ve T13243C'yi içeren dört varyantın yalnızca Sichuan ve Wuhan'da mevcut olduğu ve GISAID verilerinde bulunmadığı bulundu; bu, bu varyantların Wuhan'dan geliştirilme ihtimalinin çok yüksek olduğunu gösteriyor. Hastaların seyahat kayıtları.
Maksimum olasılık (ML) yöntemi ve Bayesian moleküler saat yaklaşımlarıyla evrimsel analiz, Sichuan'dan 88 yeni virüs ve diğer bölgelerden seçilmiş 250 genom üzerinde işlendi.∆500-532'ye sahip genomların (Nsp1 kodlama bölgesindeki silinmeler) filogenetik ağaçta seyrek olarak dağıldığı bulundu.Nsp1 varyantları üzerinde yapılan Haplotip analizi, bunlardan 5'inin birden fazla şehirden olduğunu tespit etti.Bu sonuçlar ∆500-532'nin birden fazla şehirde meydana geldiğini ve Wuhan'dan birden çok kez ithal edilebileceğini gösterdi.
Şekil 2. SARS-CoV-2 genomlarında tekrarlayan genetik varyantlar ve filogenetik analiz
3. Tekrarlayan genetik varyantların klinik çıkarımlarla ilişkisi
117 klinik fenotip, COVID-19 ciddiyeti ile ilişkilendirildi; şiddete bağlı 19 fenotip, şiddetli ve şiddetli olmayan özellikler olarak sınıflandırıldı.Bu özellikler ile 35 tekrarlayan genetik varyant arasındaki ilişki, iki kümeli ısı haritasında görselleştirildi.GSEA benzeri sıralı bir zenginleştirme analizi, ∆500-532'nin kandaki ESR, serum IFN-β ve CD3+CD8+ T hücresi sayımlarıyla negatif ilişkili olduğunu gösterdi.Ayrıca qPCR testleri, ∆500-532 içeren virüsle enfekte hastaların en yüksek Ct değerine, yani en düşük viral yüke sahip olduğunu gösterdi.
Şekil 3. Tekrarlayan 35 genetik varyantın klinik fenotiplerle ilişkisi
4. Viral mutasyonla ilişkili klinik fenotiplerin doğrulanması
∆500-532'nin Nsp1 fonksiyonları üzerindeki etkilerini anlamak için HEK239T hücreleri, tam uzunlukta eksprese eden plazmidler, WT Nsp1 ve delesyonlu mutant formlarla transfekte edildi.Tedavi edilen her HEK239T hücresinin transkriptom profilleri, PCA analizi için işlendi; bu, silme mutantlarının nispeten daha yakın kümelendiğini ve WT Nsp1'den önemli ölçüde farklı olduğunu gösterdi.Mutantlarda önemli ölçüde yukarı regüle edilen genler esas olarak "peptit biyosentetik/metabolik süreç", "ribonükleoprotein kompleksi biyogenezi", "membran/ER'yi hedefleyen protein" vb. açısından zenginleştirildi. Ayrıca, iki silme, WT'den farklı bir ekspresyon modeli gösterdi.
Şekil 4. WT Nsp1 ile transfekte edilmiş ve silinmiş HEK239T hücrelerinde transkriptom analizi
Aşırı eksprese edilen çalışmada delesyonların IFN-1 yanıtı üzerindeki etkileri de test edildi.Test edilen tüm silmelerin, transfekte edilmiş HEK239T ve A549 hücrelerinde hem transkriptom seviyesinde hem de protein seviyesinde IFN-1 tepkisini azalttığı gösterilmiştir.İlginç bir şekilde, silmelerdeki önemli ölçüde aşağı regüle edilen genler, "virüse karşı savunma tepkisi", "viral genom replikasyonu", "RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonun düzenlenmesi" ve "tip I interferona yanıt" açısından zenginleştirildi.
Şekil 5. ∆500-532 mutantında interferon sinyal yollarının aşağı regülasyonu
Bu çalışmada bu delesyonların virüs üzerindeki etkisi viral enfeksiyon çalışmaları ile daha da doğrulandı.Belirli mutantlara sahip virüsler klinik örneklerden izole edildi ve Calu-3 hücrelerine enfekte edildi.Viral enfeksiyon çalışmasına ilişkin ayrıntılı sonuçlar makalede okunabilir.
yap:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referans
Lin J, Tang C, Wei H ve diğerleri.SARS-CoV-2'nin genomik izlenmesi, tip I interferon yanıtını modüle eden bir Nsp1 delesyon varyantını ortaya çıkarır[J].Hücre konakçısı ve mikrop, 2021.
Haberler ve Öne Çıkanlar Biomarker Technologies ile en son başarılı vakaları paylaşmayı, yeni bilimsel başarıların yanı sıra çalışma sırasında uygulanan öne çıkan teknikleri yakalamayı amaçlamaktadır.
Gönderim zamanı: Ocak-06-2022