RESEQENING CEO GENOM
Genomsko praćenje SARS-CoV-2 otkriva varijantu brisanja Nsp1 koja modulira odgovor interferona tipa I
Nanopore |Illumina |Ponovno sekvenciranje cijelog genoma |metagenomika |RNA-Seq |Sanger
Biomarker Technologies je pružio tehničku podršku za sekvenciranje uzoraka u ovoj studiji.
Highlights
1. Sekvenciranje genoma SARS-CoV-2 i filognetska analiza identificiraju 35 ponavljajućih mutacija uključujući 31 SNP i 4 Indela.
2. Povezanost sa 117 kliničkih fenotipova otkriva potencijal
važne mutacije.
∆500-532 u regiji kodiranja Nsp1 korelira sa nižim virusom
3. opterećenje i serumski IFN-β.
4. Virusni izolati s mutacijom ∆500-532 induciraju niži IFN-I
odgovor u inficiranim ćelijama.
Eksperimentalni dizajn
Dostignuća
1. Epidemiološki i genomski nadzor COVID-19
Klinički podaci prikupljeni su u provinciji Sečuan u Kini tokom perioda izbijanja od 22. januara 2020. do 20. februara 2020. Ukupno 538 slučajeva COVID-19 potvrđeno je qPCR testovima u Sečuanu, od kojih je 28,8% bilo iz provincije kapital.Potvrđeni slučajevi u Sečuanu su eksponencijalno porasli, dostigavši vrhunac 30. januara.Također, podaci potvrđuju da socijalno distanciranje može biti ključni faktor u sprječavanju širenja virusa.
Slika 1. Epidemiološka studija COVID-19 u provinciji Sečuan, Kina
2. Konstrukcija genoma SARS-CoV-2 i identifikacija varijanti
Sa multipleks PCR amplifikacijom praćenom sekvenciranjem nanopora, generirano je ukupno 310 skoro ili djelomično kompletnih genoma od 248 pacijenata sa pribl.80% genoma pokriveno je sa 10 čitanja (srednja dubina: 0,39 M čitanja po uzorku).
Slika 2. Učestalost svake varijante u kohorti Sečuana
Iz genoma SARS-CoV-2 identificirano je ukupno 104 SNP-a i 18 Indela, u kojima su 31 SNP-a i 4 Indela identificirane kao rekurentne genetske varijante.Upoređujući ih sa 169 uzoraka iz Wuhana i sa 81.391 visokokvalitetnim sekvencama javnog genoma u GISAID-u, 29 od 35 pronađenih varijanti predstavljeno je na drugim kontinentima.Značajno je da su četiri varijante, uključujući ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 i T13243C, pronađene samo u Sečuanu i Wuhanu, a odsutne u podacima GISAID-a, što ukazuje na to da su ove varijante vrlo vjerovatno bile improtirane iz Wuhana, koji zadovoljavaju putne evidencije pacijenata.
Evoluciona analiza sa metodom maksimalne vjerovatnoće (ML) i pristupima Bayesovog molekularnog sata obrađena je na 88 novih virusa iz Sečuana i 250 kuriranih genoma iz drugih regija.Genomi sa ∆500-532 (delecije u oblasti kodiranja Nsp1) pronađeni su slabo raspoređeni u filogenetskom stablu.Analiza haplotipa na varijantama Nsp1 identificirala je njih 5 iz više gradova.Ovi rezultati sugeriraju da se ∆500-532 pojavio u više gradova i da bi mogao biti uvezen više puta iz Wuhana.
Slika 2. Rekurentne genetske varijante i filogenetska analiza u genomima SARS-CoV-2
3. Povezanost rekurentnih genetskih varijanti s kliničkim implikacijama
117 kliničkih fenotipova bilo je povezano s težinom COVID-19, pri čemu je 19 fenotipova povezanih s ozbiljnošću klasificirano u teške i neteške osobine.Veza između ovih osobina i 35 rekurentnih genetskih varijanti prikazana je u bi-klaster toplotnoj karti.Analiza rangiranja obogaćivanja slična GSEA pokazala je da je ∆500-532 u negativnoj korelaciji sa ESR, serumskim IFN-β i CD3+CD8+ T ćelija u krvi.Štaviše, qPCR testovi su pokazali da pacijenti inficirani virusom ∆500-532 imaju najveću Ct vrijednost, odnosno najmanji virusni teret.
Slika 3. Asocijacije 35 rekurentnih genetskih varijanti sa kliničkim fenotipovima
4. Validacija kliničkih fenotipova povezanih s mutacijom virusa
Kako bi se razumjeli utjecaji ∆500-532 na funkcije Nsp1, ćelije HEK239T su transficirane plazmidima koji eksprimiraju punu dužinu, WT Nsp1 i mutantne forme s delcijama.Profili transkriptoma svake tretirane ćelije HEK239T obrađeni su za PCA analizu, pokazujući da su delecijski mutanti grupirani relativno bliže i da su značajno različiti od WT Nsp1.Geni koji su značajno pojačani kod mutanta bili su uglavnom obogaćeni "peptidnim biosintetičkim/metaboličkim procesom", "biogenezom kompleksa ribonukleoproteina", "ciljanjem proteina na membranu/ER", itd. Štaviše, dvije delecije su pokazale različit obrazac ekspzije iz WT.
Slika 4. Analiza transkriptoma na ćelijama HEK239T transficiranih sa WT Nsp1 i one sa delecijama
Utjecaj delecija na IFN-1 odgovor je također testiran u studiji sa pretjeranom ekspresijom.Pokazalo se da sve testirane delecije smanjuju IFN-1 odgovor u transficiranim ćelijama HEK239T i A549 i na nivou transkriptoma i na nivou proteina.Zanimljivo je da su značajno smanjeni geni u delecijama bili obogaćeni "odbrambenim odgovorom na virus", "replikacijom virusnog genoma", "regulacijom transkripcije pomoću RNA polimeraze II" i "odgovorom na interferon tipa I".
Slika 5. Regulacija naniže signalnih puteva interferona kod mutanta ∆500-532
U ovoj studiji, uticaj ovih delecija na virus dodatno je potvrđen studijama virusnih infekcija.Virusi sa određenim mutantima izolovani su iz kliničkih uzoraka i inficirani u Calu-3 ćelije.Detaljni rezultati istraživanja virusnih infekcija mogu se pročitati u radu.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referenca
Lin J, Tang C, Wei H, et al.Genomski monitoring SARS-CoV-2 otkriva varijantu delecije Nsp1 koja modulira odgovor interferona tipa I[J].Ćelijski domaćin i mikrob, 2021.
Vijesti i istaknuti detalji ima za cilj dijeljenje najnovijih uspješnih slučajeva sa Biomarker Technologies, bilježi nova naučna dostignuća, kao i istaknute tehnike primijenjene tokom studije.
Vrijeme objave: Jan-06-2022