RESEQUENING VAN HET HELE GENOOM
Genomics-monitoring van SARS-CoV-2 onthult een Nsp1-deletievariant die de type I-interferonrespons moduleert
Nanoporie |Illumina |Hersequencing van het hele genoom |metagenomica |RNA-Seq |Sanger
Biomarker Technologies bood technische ondersteuning bij het sequencen van monsters in dit onderzoek.
Hoogtepunten
1. SARS-CoV-2-genoomsequencing en fylogenetische analyse identificeren 35 terugkerende mutaties, waaronder 31 SNP's en 4 Indels.
2. Associatie met 117 klinische fenotypes onthult potentieel
belangrijke mutaties.
∆500-532 in het voor Nsp1 coderende gebied correleert met lager viraal
3. belasting en serum IFN-β.
4. Virale isolaten met de ∆500-532-mutatie induceren een lagere IFN-I
reactie in de geïnfecteerde cellen.
Experimenteel ontwerp
Prestaties
1. Epidemiologische en genomische surveillance van COVID-19
Klinische gegevens werden verzameld in de provincie Sichuan, China gedurende de uitbraakperiode van 22 januari 2020 tot 20 februari 2020. In totaal werden 538 COVID-19-gevallen bevestigd door qPCR-tests in Sichuan, waarvan 28,8% afkomstig was uit de provincie. hoofdstad.Het aantal bevestigde gevallen in Sichuan nam exponentieel toe, met een piek op 30 januari.Gegevens ondersteunden ook dat sociale afstand nemen een sleutelfactor kan zijn bij het voorkomen van virusverspreiding.
Figuur 1. Epidemiologisch onderzoek naar COVID-19 in de provincie Sichuan, China
2. Constructie van het SARS-CoV-2-genoom en identificatie van varianten
Met multiplex PCR-amplificatie gevolgd door sequencing van nanoporiën werden in totaal 310 bijna of gedeeltelijk complete genomen van 248 patiënten gegenereerd met ongeveer.80% van de genomen gedekt door 10 metingen (gemiddelde diepte: 0,39 miljoen metingen per monster).
Figuur 2. Frequentie van elke variant in het Sichuan-cohort
In totaal werden 104 SNP’s en 18 Indels geïdentificeerd uit SARS-CoV-2-genomen, waarbij 31 SNP’s en 4 Indels werden geïdentificeerd als terugkerende genetische varianten.Door ze te vergelijken met 169 monsters uit Wuhan en met 81.391 hoogwaardige publieke genoomsequenties in GISAID, werden 29 van de 35 gevonden varianten gepresenteerd op andere continenten.Met name vier varianten, waaronder ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 en T13243C, bleken alleen aanwezig te zijn in Sichuan en Wuhan en afwezig in GISAID-gegevens, wat aangeeft dat deze varianten zeer waarschijnlijk afkomstig waren uit Wuhan, die voldoen aan de reisgegevens van patiënten.
Evolutionaire analyse met maximale waarschijnlijkheidsmethode (ML) en Bayesiaanse moleculaire klokbenaderingen werd verwerkt op 88 nieuwe virussen uit Sichuan en 250 samengestelde genomen uit andere regio's.Genomen met ∆500-532 (deleties in het Nsp1-coderende gebied) werden schaars verspreid in de fylogenetische boom gevonden.Haplotype-analyse van Nsp1-varianten identificeerde er vijf uit meerdere steden.Deze resultaten suggereerden dat de ∆500-532 in meerdere steden voorkwam en mogelijk meerdere keren vanuit Wuhan werd geïmporteerd.
Figuur 2. Terugkerende genetische varianten en fylogenetische analyse in de SARS-CoV-2-genomen
3. Associatie van terugkerende genetische varianten met klinische implicaties
117 klinische fenotypes werden geassocieerd met de ernst van COVID-19, waarbij 19 aan de ernst gerelateerde fenotypes werden geclassificeerd in ernstige en niet-ernstige kenmerken.De relatie tussen deze eigenschappen en 35 terugkerende genetische varianten werd gevisualiseerd in een bi-cluster heatmap.Een GSEA-achtige gerangschikte verrijkingsanalyse toonde aan dat ∆500-532 negatief gecorreleerd is met ESR, serum IFN-β en CD3+CD8+ T-celaantallen in het bloed.Bovendien toonden qPCR-tests aan dat patiënten die geïnfecteerd waren met een virus met ∆500-532 de hoogste Ct-waarde hadden, dat wil zeggen de laagste virale lading.
Figuur 3. Associaties van 35 terugkerende genetische varianten met klinische fenotypes
4. Validatie van met virale mutaties geassocieerde klinische fenotypes
Om de effecten van ∆500-532 op Nsp1-functies te begrijpen, werden HEK239T-cellen getransfecteerd met plasmiden die WT Nsp1 van volledige lengte en mutante vormen met deleties tot expressie brengen.Transcriptoomprofielen van elke behandelde HEK239T-cellen werden verwerkt voor PCA-analyse, wat aantoont dat deletiemutanten relatief dichter bij elkaar waren geclusterd en significant verschilden van WT Nsp1.De genen die significant opgereguleerd waren in de mutanten waren voornamelijk verrijkt in “peptidebiosynthetisch/metabolisch proces”, “ribonucleoproteïnecomplexbiogenese”, “eiwittargeting naar membraan/ER”, enz. Bovendien vertoonden twee deleties een duidelijk expansiepatroon van WT.
Figuur 4. Transcriptoomanalyse van HEK239T-cellen getransfecteerd door WT Nsp1 en die met deleties
De invloed van deleties op de IFN-1-respons werd ook getest in onderzoek naar overexpressie.Van alle geteste deleties werd aangetoond dat ze de IFN-1-respons in getransfecteerde HEK239T- en A549-cellen op zowel transcriptoomniveau als eiwitniveau verminderen.Interessant is dat de aanzienlijk naar beneden gereguleerde genen in deleties verrijkt waren in “verdedigingsreactie op virus”, “virale genoomreplicatie”, “regulatie van transcriptie door RNA-polymerase II” en “respons op type I interferon”.
Figuur 5. Neerwaartse regulatie van interferonsignaleringsroutes in de ∆500-532-mutant
In deze studie werd de impact van deze deleties op het virus verder bevestigd door onderzoeken naar virale infecties.Virussen met bepaalde mutanten werden geïsoleerd uit klinische monsters en geïnfecteerd met Calu-3-cellen.Gedetailleerde resultaten van het onderzoek naar virale infecties zijn te lezen in de krant.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referentie
Lin J, Tang C, Wei H, et al.Genomische monitoring van SARS-CoV-2 onthult een Nsp1-deletievariant die de type I-interferonrespons moduleert[J].Celgastheer en microbe, 2021.
Nieuws en hoogtepunten heeft tot doel de nieuwste succesvolle cases te delen met Biomarker Technologies, waarbij nieuwe wetenschappelijke prestaties worden vastgelegd, evenals prominente technieken die tijdens het onderzoek worden toegepast.
Posttijd: 06-jan-2022