RESKVENIRANJE CELOTNEGA GENOMA
Genomsko spremljanje SARS-CoV-2 odkrije delecijsko različico Nsp1, ki modulira odziv interferona tipa I
Nanopore |Illumina |Ponovno zaporedje celotnega genoma |metagenomika |RNA-Seq |Sanger
Biomarker Technologies je zagotovil tehnično podporo pri določanju zaporedja vzorcev v tej študiji.
Poudarki
1. Sekvenciranje genoma SARS-CoV-2 in filogenska analiza identificirata 35 ponavljajočih se mutacij, vključno z 31 SNP in 4 Indeli.
2. Povezava s 117 kliničnimi fenotipi razkriva potencial
pomembne mutacije.
∆500-532 v kodirni regiji Nsp1 je v korelaciji z nižjo virusno
3.obremenitev in serum IFN-β.
4. Virusni izolati z mutacijo ∆500-532 inducirajo nižji IFN-I
odziv v okuženih celicah.
Eksperimentalno načrtovanje
Dosežki
1. Epidemiološki in genomski nadzor COVID-19
Klinični podatki so bili zbrani v provinci Sečuan na Kitajskem v obdobju izbruha od 22. januarja 2020 do 20. februarja 2020. S testi qPCR v Sečuanu je bilo potrjenih skupno 538 primerov COVID-19, od tega 28,8 % iz province kapitala.Potrjeni primeri v Sečuanu so se eksponentno povečali in dosegli vrhunec 30. januarja.Podatki so tudi potrdili, da je socialna distanca lahko ključni dejavnik pri preprečevanju širjenja virusa.
Slika 1. Epidemiološka študija COVID-19 v provinci Sečuan na Kitajskem
2. Konstrukcija genoma SARS-CoV-2 in identifikacija različic
Z večkratnim pomnoževanjem PCR, ki mu je sledilo sekvenciranje nanopor, je bilo ustvarjenih skupno 310 skoraj ali delno popolnih genomov 248 bolnikov s pribl.80 % genomov pokritih z 10 odčitki (povprečna globina: 0,39 M odčitkov na vzorec).
Slika 2. Pogostost vsake različice v sečuanski kohorti
Iz genomov SARS-CoV-2 je bilo identificiranih skupno 104 SNP-jev in 18 Indelov, v katerih je bilo 31 SNP-jev in 4 Indeli identificiranih kot ponavljajoče se genetske različice.Če jih primerjamo s 169 vzorci iz Wuhana in z 81.391 visokokakovostnimi javnimi zaporedji genoma v GISAID, je 29 od 35 najdenih različic predstavljenih na drugih celinah.Predvsem je bilo ugotovljeno, da so štiri različice, vključno z ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 in T13243C, prisotne le v Sečuanu in Vuhanu in jih ni bilo v podatkih GISAID, kar kaže, da so bile te različice zelo verjetno uvedene iz Wuhana, ki izpolnjujejo zahteve potne evidence bolnikov.
Evolucijska analiza z metodo največje verjetnosti (ML) in pristopom Bayesove molekularne ure je bila obdelana na 88 novih virusih iz Sečuana in 250 kuriranih genomih iz drugih regij.Ugotovljeno je bilo, da so genomi z ∆500-532 (delecije v kodirni regiji Nsp1) redko porazdeljeni v filogenetskem drevesu.Analiza haplotipov na različicah Nsp1 je identificirala 5 od njih iz več mest.Ti rezultati kažejo, da se je ∆500-532 pojavil v več mestih in bi bil lahko večkrat uvožen iz Wuhana.
Slika 2. Ponavljajoče se genetske različice in filogenetska analiza v genomih SARS-CoV-2
3. Povezava ponavljajočih se genetskih variant s kliničnimi posledicami
117 kliničnih fenotipov je bilo povezanih z resnostjo COVID-19, pri čemer je bilo 19 fenotipov, povezanih z resnostjo, razvrščenih v hude in manj hude lastnosti.Razmerje med temi lastnostmi in 35 ponavljajočimi se genetskimi različicami je bilo vizualizirano v toplotni karti dveh grozdov.Analiza obogatitve, podobna GSEA, je pokazala, da je ∆500-532 v negativni korelaciji z ESR, serumskim IFN-β in številom celic T CD3+CD8+ v krvi.Poleg tega so testi qPCR pokazali, da imajo bolniki, okuženi z virusom ∆500-532, najvišjo vrednost Ct, torej najmanjšo virusno obremenitev.
Slika 3. Povezave 35 ponavljajočih se genetskih variant s kliničnimi fenotipi
4. Validacija kliničnih fenotipov, povezanih z virusno mutacijo
Da bi razumeli vplive ∆500-532 na funkcije Nsp1, smo celice HEK239T transficirali s plazmidi, ki izražajo polno dolžino, WT Nsp1 in mutirane oblike z delecijami.Profili transkriptoma vsake obdelane celice HEK239T so bili obdelani za analizo PCA, ki je pokazala, da so delecijski mutanti združeni relativno bližje in so se znatno razlikovali od WT Nsp1.Geni, ki so bili v mutantih znatno regulirani navzgor, so bili v glavnem obogateni s »biosintetskim/presnovnim procesom peptidov«, »biogenezo ribonukleoproteinskega kompleksa«, »usmerjanjem beljakovin na membrano/ER« itd. Poleg tega sta dve deleciji pokazali razločen vzorec ekspresije iz WT.
Slika 4. Analiza transkriptoma na celicah HEK239T, transficiranih z WT Nsp1 in tistih z delecijami
Vpliv delecij na odziv IFN-1 je bil preizkušen tudi v študiji prekomerne ekspresije.Pokazalo se je, da vse testirane delecije zmanjšajo odziv IFN-1 v transfektiranih celicah HEK239T in A549 na ravni transkriptoma in beljakovin.Zanimivo je, da so bili znatno znižani geni v delecijah obogateni z "obrambnim odzivom na virus", "replikacijo virusnega genoma", "regulacijo transkripcije z RNA polimerazo II" in "odzivom na interferon tipa I".
Slika 5. Znižana regulacija interferonskih signalnih poti pri mutantu ∆500-532
V tej študiji je bil vpliv teh izbrisov na virus dodatno potrjen s študijami virusnih okužb.Iz kliničnih vzorcev smo izolirali viruse z določenimi mutanti in jih okužili v celice Calu-3.Podrobne rezultate študije virusnih okužb lahko preberete v prispevku.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referenca
Lin J, Tang C, Wei H, et al.Genomsko spremljanje SARS-CoV-2 odkrije delecijsko različico Nsp1, ki modulira odziv interferona tipa I [J].Celični gostitelj in mikrob, 2021.
Novice in poudarki želi deliti najnovejše uspešne primere z Biomarker Technologies, zajeti nove znanstvene dosežke in vidne tehnike, uporabljene med študijo.
Čas objave: 6. januarja 2022