ПЕРЕКВЕНЦЫЯ ПОЎНАГА ГЕНОМА
Геномічны маніторынг SARS-CoV-2 выяўляе варыянт выдалення Nsp1, які мадулюе адказ інтэрферону I тыпу
Нанапор |Ілюміна |Рэсеквенаванне поўнага геному |метагеноміка |РНК-Seq |Сэнгер
Кампанія Biomarker Technologies аказала тэхнічную падтрымку па секвеніраванні ўзораў у гэтым даследаванні.
Асноўныя моманты
1. Секвенирование генома SARS-CoV-2 і філагнетычны аналіз ідэнтыфікуюць 35 рэцыдывавальных мутацый, уключаючы 31 SNP і 4 індэлі.
2.Асацыяцыя з 117 клінічнымі фенатыпу раскрывае патэнцыял
важныя мутацыі.
∆500-532 у вобласці кадавання Nsp1 карэлюе з больш нізкім узроўнем віруса
3.load і сыроватачна IFN-β.
4. Вірусныя ізаляты з мутацыяй ∆500-532 індукуюць больш нізкі IFN-I
адказ у заражаных клетках.
Эксперыментальны дызайн
Дасягненні
1. Эпідэміялагічны і геномны нагляд за COVID-19
Клінічныя дадзеныя збіраліся ў правінцыі Сычуань, Кітай, за перыяд успышкі захворвання з 22 студзеня 2020 г. па 20 лютага 2020 г. У агульнай складанасці 538 выпадкаў COVID-19 былі пацверджаны тэстамі qPCR у Сычуань, 28,8% з якіх былі ў правінцыі капітал.Колькасць пацверджаных выпадкаў у Сычуані павялічвалася ў геаметрычнай прагрэсіі, дасягнуўшы піка 30 студзеня.Акрамя таго, дадзеныя пацвярджаюць, што сацыяльнае дыстанцыяванне можа быць ключавым фактарам у прадухіленні распаўсюджвання віруса.
Малюнак 1. Эпідэміялагічнае даследаванне COVID-19 у правінцыі Сычуань, Кітай
2. Канструкцыя геному SARS-CoV-2 і ідэнтыфікацыя варыянтаў
З дапамогай мультыплекснай ПЦР-ампліфікацыі з наступным секвенированием нанапор было атрымана ў агульнай складанасці 310 амаль або часткова поўных геномаў 248 пацыентаў з прыбл.80% геномаў ахопліваюць 10 чытанняў (сярэдняя глыбіня: 0,39 М чытанняў на ўзор).
Малюнак 2. Частата кожнага варыянту ў сычуаньскай кагорце
У агульнай складанасці 104 SNP і 18 індэляў былі ідэнтыфікаваны з геномаў SARS-CoV-2, у якіх 31 SNP і 4 індэлі былі ідэнтыфікаваны як рэцыдывавальныя генетычныя варыянты.Параўноўваючы іх са 169 узорамі з Уханя і з 81 391 высакаякаснай публічнай паслядоўнасцю геному ў GISAID, 29 з 35 знойдзеных варыянтаў прадстаўлены на іншых кантынентах.Характэрна, што чатыры варыянты, у тым ліку ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 і T13243C, былі знойдзены толькі ў Сычуані і Ухані і адсутнічалі ў дадзеных GISAID, што паказвае на тое, што гэтыя варыянты, хутчэй за ўсё, былі завезены з Уханя, які адпавядае патрабаванням пуцёўкі пацыентаў.
Эвалюцыйны аналіз з выкарыстаннем метаду максімальнага верагоднасці (ML) і байесаўскага малекулярнага гадзінніка быў апрацаваны на 88 новых вірусах з Сычуані і 250 курыраваных геномах з іншых рэгіёнаў.Геномы з ∆500-532 (дэлецыі ў вобласці кадавання Nsp1) былі знойдзены рэдка размеркаванымі ў філагенетычным дрэве.Аналіз гаплатыпаў варыянтаў Nsp1 выявіў 5 з іх з некалькіх гарадоў.Гэтыя вынікі дазваляюць выказаць здагадку, што ∆500-532 сустракаўся ў некалькіх гарадах і мог некалькі разоў імпартавацца з Уханя.
Малюнак 2. Рэцыдывавальныя генетычныя варыянты і філагенетычны аналіз у геномах SARS-CoV-2
3. Сувязь рэцыдывавальных генетычных варыянтаў з клінічнымі наступствамі
117 клінічных фенатыпаў былі звязаны з цяжарам COVID-19, дзе 19 фенатыпаў, звязаных са ступенню цяжкасці, былі класіфікаваны на цяжкія і няцяжкія прыкметы.Адносіны паміж гэтымі прыкметамі і 35 паўтаральнымі генетычнымі варыянтамі былі візуалізаваны ў двухкластарнай цеплавой карце.Ранжыраваны аналіз ўзбагачэння, падобны на GSEA, паказаў, што ∆500-532 адмоўна карэлюе з СОЭ, IFN-β і колькасцю Т-клетак CD3+CD8+ у крыві.Акрамя таго, тэсты кПЦР паказалі, што пацыенты, інфіцыраваныя вірусам ∆500-532, мелі самае высокае значэнне Ct, гэта значыць найменшую вірусную нагрузку.
Малюнак 3. Асацыяцыі 35 паўтаральных генетычных варыянтаў з клінічнымі фенатыпу
4. Праверка клінічных фенатыпаў, звязаных з мутацыямі віруса
Для таго, каб зразумець уплыў ∆500-532 на функцыі Nsp1, клеткі HEK239T трансфікавалі плазмидами, экспрессирующими поўнаметражныя, WT Nsp1 і мутантныя формы з дэлецыямі.Профілі транскрыптому кожнай апрацаванай клеткі HEK239T былі апрацаваны для аналізу PCA, які паказаў, што делеционные мутанты групуюцца адносна бліжэй і значна адрозніваюцца ад WT Nsp1.Гены, якія былі значна павышана ў мутантаў, былі ў асноўным узбагачаны «біясінтэтычным/метабалічным працэсам пептыдаў», «біягенезам рыбануклеапратэінавага комплексу», «накіраваннем бялку на мембрану/ER» і г. д. Больш за тое, дзве дэлецыі паказалі выразную карціну экспрэсіі ад WT.
Малюнак 4. Аналіз транскрыптому на клетках HEK239T, трансфікаваных WT Nsp1 і з дэлецыямі
Уплыў делеций на рэакцыю IFN-1 таксама быў правераны ў даследаванні празмернай экспрэсіі.Было паказана, што ўсе правераныя дэлецыі зніжаюць рэакцыю IFN-1 у трансфікаваных клетках HEK239T і A549 як на ўзроўні транскрыптама, так і на ўзроўні бялку.Цікава, што значна паніжаная рэгуляцыя генаў у делециях была ўзбагачана «абарончай рэакцыяй на вірус», «рэплікацыяй віруснага геному», «рэгуляцыяй транскрыпцыі РНК-палімеразай II» і «адказам на інтэрферон тыпу I».
Малюнак 5. Паніжэнне рэгуляцыі сігнальных шляхоў інтэрферону ў мутанта ∆500-532
У гэтым даследаванні ўплыў гэтых выдаленняў на вірус быў дадаткова пацверджаны даследаваннямі вірусных інфекцый.Вірусы з пэўнымі мутантамі былі вылучаныя з клінічных узораў і заражаныя клеткамі Calu-3.Падрабязныя вынікі даследавання віруснай інфекцыі можна прачытаць у артыкуле.
зрабіць:10.1016/j.chom.2021.01.015
Даведка
Lin J, Tang C, Wei H і інш.Геномны маніторынг SARS-CoV-2 выяўляе варыянт дэлецыі Nsp1, які мадулюе рэакцыю інтэрферону I тыпу[J].Клетка-гаспадар і мікроб, 2021.
Навіны і асноўныя моманты накіравана на абмен апошнімі паспяховымі кейсамі з Biomarker Technologies, фіксаванне новых навуковых дасягненняў, а таксама вядомых метадаў, якія прымяняюцца падчас даследавання.
Час публікацыі: 6 студзеня 2022 г