RESKVENIRANJE CIJELOG GENOMA
Genomsko praćenje SARS-CoV-2 otkriva varijantu brisanja Nsp1 koja modulira odgovor interferona tipa I
Nanopore |Illumina |Resekvenciranje cijelog genoma |metagenomika |RNA-Seq |Sanger
Biomarker Technologies pružio je tehničku podršku za sekvencioniranje uzoraka u ovoj studiji.
Naglasci
1. Sekvenciranje genoma SARS-CoV-2 i filogenetska analiza identificiraju 35 ponavljajućih mutacija uključujući 31 SNP i 4 Indela.
2.Povezanost sa 117 kliničkih fenotipova otkriva potencijal
važne mutacije.
∆500-532 u Nsp1 kodirajućoj regiji korelira s nižim virusnim
3.opterećenje i serum IFN-β.
4. Izolati virusa s mutacijom ∆500-532 induciraju niži IFN-I
odgovor u zaraženim stanicama.
Eksperimentalni dizajn
Dostignuća
1. Epidemiološki i genomski nadzor COVID-19
Klinički podaci prikupljeni su u provinciji Sichuan u Kini tijekom razdoblja epidemije od 22. siječnja 2020. do 20. veljače 2020. Ukupno 538 slučajeva COVID-19 potvrđeno je qPCR testovima u Sichuanu, od kojih je 28,8% bilo iz provincije glavni.Potvrđeni slučajevi u Sichuanu eksponencijalno su porasli, dosegnuvši vrhunac 30. siječnja.Također, podaci potvrđuju da socijalno distanciranje može biti ključni čimbenik u sprječavanju širenja virusa.
Slika 1. Epidemiološka studija COVID-19 u provinciji Sichuan, Kina
2. Konstrukcija genoma SARS-CoV-2 i identifikacija varijanti
S višestrukom PCR amplificiranjem praćenom sekvenciranjem nanopora, generirano je ukupno 310 gotovo ili djelomično potpunih genoma od 248 pacijenata s približno.80% genoma pokriveno s 10 očitavanja (srednja dubina: 0,39 M očitavanja po uzorku).
Slika 2. Učestalost svake varijante u kohorti Sečuana
Ukupno 104 SNP-a i 18 Indela identificirano je iz genoma SARS-CoV-2, u kojima je 31 SNP-a i 4 Indela identificirano kao rekurentne genetske varijante.Uspoređujući ih sa 169 uzoraka iz Wuhana i s 81.391 visokokvalitetnom javnom sekvencom genoma u GISAID-u, 29 od 35 pronađenih varijanti predstavljeno je na drugim kontinentima.Značajno je da su četiri varijante, uključujući ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 i T13243C, prisutne samo u Sichuanu i Wuhanu i da ih nema u podacima GISAID-a, što ukazuje na to da su te varijante vrlo vjerojatno bile impotirane iz Wuhana, koje zadovoljavaju putne evidencije pacijenata.
Evolucijska analiza s metodom maksimalne vjerojatnosti (ML) i pristupima Bayesovog molekularnog sata obrađena je na 88 novih virusa iz Sichuana i 250 odabranih genoma iz drugih regija.Genomi s ∆500-532 (delecije u Nsp1 kodirajućoj regiji) pronađeni su rijetko raspoređeni u filogenetskom stablu.Analiza haplotipa na varijantama Nsp1 identificirala je njih 5 iz više gradova.Ovi rezultati sugeriraju da se ∆500-532 pojavio u više gradova i da bi mogao biti uvezen više puta iz Wuhana.
Slika 2. Rekurentne genetske varijante i filogenetska analiza u genomima SARS-CoV-2
3. Povezanost rekurentnih genetskih varijanti s kliničkim implikacijama
117 kliničkih fenotipova povezano je s težinom bolesti COVID-19, pri čemu je 19 fenotipova povezanih s težinom klasificirano u teške i lake osobine.Odnos između ovih osobina i 35 rekurentnih genetskih varijanti vizualiziran je u toplinskoj karti bi-klastera.Analiza rangiranja obogaćenja slična GSEA pokazala je da je ∆500-532 u negativnoj korelaciji s ESR-om, serumskim IFN-β i brojem CD3+CD8+ T stanica u krvi.Štoviše, qPCR testovi su pokazali da pacijenti zaraženi virusom koji nosi ∆500-532 imaju najvišu vrijednost Ct, odnosno najmanje virusno opterećenje.
Slika 3. Povezanost 35 rekurentnih genetskih varijanti s kliničkim fenotipovima
4. Validacija kliničkih fenotipova povezanih s virusnom mutacijom
Kako bi se razumjeli učinci ∆500-532 na funkcije Nsp1, stanice HEK239T transficirane su plazmidima koji eksprimiraju punu duljinu, WT Nsp1 i mutantne oblike s delecijama.Profili transkriptoma svake tretirane HEK239T stanice obrađeni su za PCA analizu, pokazujući da su delecijski mutanti grupirani relativno bliže i da su se značajno razlikovali od WT Nsp1.Geni koji su bili značajno pojačano regulirani u mutantima uglavnom su bili obogaćeni "biosintetskim/metaboličkim procesom peptida", "biogenezom kompleksa ribonukleoproteina", "ciljanjem proteina na membranu/ER", itd. Štoviše, dvije delecije pokazale su jasan uzorak ekspresije iz WT.
Slika 4. Analiza transkriptoma na HEK239T stanicama transficiranim WT Nsp1 i onima s delecijama
Utjecaj delecija na odgovor IFN-1 također je ispitan u studiji prekomjerne ekspresije.Pokazalo se da sve testirane delecije smanjuju odgovor IFN-1 u transficiranim HEK239T i A549 stanicama i na razini transkriptoma i na razini proteina.Zanimljivo je da su značajno smanjeno regulirani geni u delecijama obogaćeni "obrambenim odgovorom na virus", "replikacijom virusnog genoma", "regulacijom transkripcije pomoću RNA polimeraze II" i "odgovorom na interferon tipa I".
Slika 5. Niža regulacija signalnih putova interferona u ∆500-532 mutantu
U ovoj studiji, utjecaj ovih delecija na virus dodatno je potvrđen studijama virusnih infekcija.Virusi s određenim mutantima izolirani su iz kliničkih uzoraka i inficirani u Calu-3 stanice.Detaljne rezultate istraživanja virusnih infekcija možete pročitati u radu.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referenca
Lin J, Tang C, Wei H, et al.Genomsko praćenje SARS-CoV-2 otkriva varijantu brisanja Nsp1 koja modulira odgovor interferona tipa I[J].Stanični domaćin i mikrob, 2021.
Vijesti i istaknuto ima za cilj podijeliti najnovije uspješne slučajeve s Biomarker Technologies, bilježeći nova znanstvena dostignuća kao i istaknute tehnike primijenjene tijekom studije.
Vrijeme objave: 6. siječnja 2022