RESECUENCIA DEL GENOMA COMPLETO
La monitorización genómica del SARS-CoV-2 descubre una variante de deleción de Nsp1 que modula la respuesta al interferón tipo I
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Biomarker Technologies brindó soporte técnico en la secuenciación de muestras en este estudio.
Reflejos
1.La secuenciación del genoma del SARS-CoV-2 y el análisis filognético identifican 35 mutaciones recurrentes, incluidos 31 SNP y 4 Indels.
2.La asociación con 117 fenotipos clínicos revela potencialmente
mutaciones importantes.
∆500-532 en la región codificante de Nsp1 se correlaciona con una menor tasa viral
3.carga y IFN-β sérico.
4.Los aislados virales con mutación ∆500-532 inducen IFN-I más bajo
respuesta en las células infectadas.
Diseño experimental
Logros
1. Vigilancia epidemiológica y genómica de la COVID-19
Los datos clínicos se recopilaron en la provincia de Sichuan, China, durante el período del brote, del 22 de enero de 2020 al 20 de febrero de 2020. Se confirmaron un total de 538 casos de COVID-19 mediante pruebas qPCR en Sichuan, el 28,8% de los cuales eran de la provincia. capital.Los casos confirmados en Sichuan aumentaron exponencialmente y alcanzaron su punto máximo el 30 de enero.Además, los datos respaldaron que el distanciamiento social puede ser un factor clave para prevenir la propagación del virus.
Figura 1. Estudio epidemiológico de COVID-19 en la provincia de Sichuan, China
2. Construcción del genoma del SARS-CoV-2 e identificación de variantes
Con amplificación por PCR múltiple seguida de secuenciación de nanoporos, se generaron un total de 310 genomas casi completos o parciales de 248 pacientes con aprox.80% de los genomas cubiertos por 10 lecturas (profundidad media: 0,39 M de lecturas por muestra).
Figura 2. Frecuencia de cada variante en la cohorte de Sichuan
Se identificaron un total de 104 SNP y 18 Indel a partir de los genomas del SARS-CoV-2, de los cuales 31 SNP y 4 Indel se identificaron como variantes genéticas recurrentes.Al compararlas con 169 muestras de Wuhan y con 81.391 secuencias del genoma público de alta calidad en GISAID, 29 de las 35 variantes encontradas se presentaron en otros continentes.En particular, se encontró que cuatro variantes, incluidas ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 y T13243C, solo estaban presentes en Sichuan y Wuhan y estaban ausentes en los datos de GISAID, lo que indica que es muy probable que estas variantes hayan sido importadas de Wuhan, que cumplen con los requisitos. registros de viaje de los pacientes.
Se procesó un análisis evolutivo con el método de máxima verosimilitud (ML) y enfoques de reloj molecular bayesiano en 88 nuevos virus de Sichuan y 250 genomas seleccionados de otras regiones.Los genomas con ∆500-532 (deleciones en la región codificante de Nsp1) se encontraron distribuidos escasamente en el árbol filogenético.El análisis de haplotipos de las variantes de Nsp1 identificó cinco de ellas de varias ciudades.Estos resultados sugirieron que el ∆500-532 ocurrió en varias ciudades y podría importarse varias veces desde Wuhan.
Figura 2. Variantes genéticas recurrentes y análisis filogenético en los genomas del SARS-CoV-2
3. Asociación de variantes genéticas recurrentes con implicaciones clínicas
Se asociaron 117 fenotipos clínicos con la gravedad de la COVID-19, donde 19 fenotipos relacionados con la gravedad se clasificaron en rasgos graves y no graves.La relación entre estos rasgos y 35 variantes genéticas recurrentes se visualizó en un mapa de calor de dos grupos.Un análisis de enriquecimiento clasificado similar al GSEA mostró que ∆500-532 se correlaciona negativamente con la VSG, el IFN-β sérico y los recuentos de células T CD3+CD8+ en la sangre.Además, las pruebas de qPCR mostraron que los pacientes infectados con virus que albergaban ∆500-532 tenían el valor de Ct más alto, es decir, la carga viral más baja.
Figura 3. Asociaciones de 35 variantes genéticas recurrentes con fenotipos clínicos
4. Validación de fenotipos clínicos asociados a mutaciones virales.
Para comprender los efectos de ∆500-532 en las funciones de Nsp1, se transfectaron células HEK239T con plásmidos que expresaban Nsp1 WT de longitud completa y formas mutantes con deleciones.Los perfiles de transcriptoma de cada célula HEK239T tratada se procesaron para el análisis de PCA, lo que muestra que los mutantes de eliminación se agruparon relativamente más cerca y eran significativamente diferentes de WT Nsp1.Los genes que estaban significativamente regulados positivamente en los mutantes se enriquecieron principalmente en "proceso biosintético/metabólico de péptidos", "biogénesis del complejo de ribonucleoproteína", "proteína dirigida a la membrana/RE", etc. Además, dos eliminaciones mostraron un patrón de expresión distinto del WT.
Figura 4. Análisis del transcriptoma en células HEK239T transfectadas por WT Nsp1 y con deleciones
Los efectos de las deleciones sobre la respuesta de IFN-1 también se probaron en un estudio sobreexpresado.Se demostró que todas las eliminaciones probadas reducen la respuesta de IFN-1 en células HEK239T y A549 transfectadas tanto a nivel de transcriptoma como a nivel de proteína.Curiosamente, los genes significativamente regulados negativamente en las deleciones se enriquecieron en "respuesta de defensa al virus", "replicación del genoma viral", "regulación de la transcripción por la ARN polimerasa II" y "respuesta al interferón tipo I".
Figura 5. Regulación negativa de las vías de señalización del interferón en el mutante ∆500-532
En este estudio, el impacto de estas eliminaciones en el virus se confirmó mediante estudios de infección viral.Se aislaron virus con ciertos mutantes a partir de muestras clínicas y se infectaron células Calu-3.Los resultados detallados del estudio de la infección viral se pueden leer en el artículo.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referencia
Lin J, Tang C, Wei H, et al.La monitorización genómica del SARS-CoV-2 descubre una variante de eliminación de Nsp1 que modula la respuesta al interferón tipo I [J].Huésped celular y microbio, 2021.
Noticias y destacados tiene como objetivo compartir los últimos casos exitosos con Biomarker Technologies, capturando logros científicos novedosos, así como técnicas destacadas aplicadas durante el estudio.
Hora de publicación: 06-ene-2022