Ponowne sekwencjonowanie całego genomu
Monitorowanie genomiki SARS-CoV-2 odkrywa wariant delecji Nsp1, który moduluje odpowiedź interferonu typu I
Nanopor |Ilumina |Ponowne sekwencjonowanie całego genomu |metagenomika |Sekwencja RNA |Sanger
W tym badaniu firma Biomarker Technologies zapewniła wsparcie techniczne w zakresie sekwencjonowania próbek.
Przegląd najważniejszych wydarzeń
1. Sekwencjonowanie genomu SARS-CoV-2 i analiza filognetyczna pozwalają zidentyfikować 35 powtarzających się mutacji, w tym 31 SNP i 4 Indele.
2. Powiązanie ze 117 fenotypami klinicznymi ujawnia potencjał
ważne mutacje.
∆500-532 w regionie kodującym Nsp1 koreluje z niższym wirusem
3.ładunek i surowica IFN-β.
4.Izolaty wirusa z mutacją ∆500-532 indukują niższy poziom IFN-I
odpowiedź w zakażonych komórkach.
Eksperymentalny projekt
Osiągnięcia
1. Nadzór epidemiologiczny i genomiczny nad wirusem COVID-19
Dane kliniczne zebrano w prowincji Syczuan w Chinach w okresie epidemii od 22 stycznia 2020 r. do 20 lutego 2020 r. W sumie za pomocą testów qPCR potwierdzono w Syczuanie 538 przypadków COVID-19, z czego 28,8% pochodziło z prowincji kapitał.Potwierdzone przypadki w Syczuanie wzrosły wykładniczo, osiągając szczyt 30 stycznia.Dane potwierdziły również, że dystans społeczny może być kluczowym czynnikiem zapobiegania rozprzestrzenianiu się wirusa.
Rycina 1. Badanie epidemiologiczne dotyczące COVID-19 w prowincji Syczuan w Chinach
2. Konstrukcja genomu SARS-CoV-2 i identyfikacja wariantów
Dzięki multipleksowej amplifikacji PCR, a następnie sekwencjonowaniu nanoporów, wygenerowano w sumie 310 prawie lub częściowo kompletnych genomów od 248 pacjentów z ok.80% genomów objętych 10 odczytami (średnia głębokość: 0,39 M odczytów na próbkę).
Rycina 2. Częstotliwość poszczególnych wariantów w kohorcie syczuańskiej
Z genomów SARS-CoV-2 zidentyfikowano łącznie 104 SNP i 18 Indelów, z czego 31 SNP i 4 Indele zidentyfikowano jako powtarzające się warianty genetyczne.Porównując je ze 169 próbkami z Wuhan i 81 391 wysokiej jakości publicznymi sekwencjami genomu w GISAID, 29 z 35 znalezionych wariantów prezentowało się na innych kontynentach.Warto zauważyć, że cztery warianty, w tym ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 i T13243C, stwierdzono jedynie w Syczuanie i Wuhan i nie było ich w danych GISAID, co wskazuje, że z dużym prawdopodobieństwem warianty te zostały zaimportowane z Wuhan, które spełniają kryteria dokumentacja podróży pacjentów.
Analizę ewolucyjną z zastosowaniem metody największej wiarygodności (ML) i podejścia do zegara molekularnego Bayesa przeprowadzono na 88 nowych wirusach z Syczuanu i 250 wyselekcjonowanych genomach z innych regionów.Stwierdzono, że genomy z ∆500-532 (delecje w regionie kodującym Nsp1) są rozmieszczone rzadko w drzewie filogenetycznym.Analiza haplotypów wariantów Nsp1 pozwoliła zidentyfikować 5 z nich z wielu miast.Wyniki te sugerują, że ∆500-532 występował w wielu miastach i mógł być wielokrotnie importowany z Wuhan.
Rycina 2. Powtarzające się warianty genetyczne i analiza filogenetyczna genomów SARS-CoV-2
3. Związek nawracających wariantów genetycznych z implikacjami klinicznymi
117 fenotypów klinicznych powiązano z ciężkością choroby COVID-19, przy czym 19 fenotypów związanych z ciężkością sklasyfikowano jako cechy ciężkie i łagodne.Zależność między tymi cechami a 35 powtarzającymi się wariantami genetycznymi wizualizowano na mapie termicznej dwuklastrowej.Analiza wzbogacania rankingowego podobna do GSEA wykazała, że ∆500-532 jest ujemnie skorelowane z ESR, liczbą limfocytów T CD3+CD8+ we krwi i IFN-β w surowicy.Ponadto badania qPCR wykazały, że pacjenci zakażeni wirusem niosącym ∆500-532 mieli najwyższą wartość Ct, czyli najniższą wiremię.
Rycina 3. Powiązania 35 powtarzających się wariantów genetycznych z fenotypami klinicznymi
4. Walidacja fenotypów klinicznych związanych z mutacjami wirusowymi
Aby zrozumieć wpływ ∆500-532 na funkcje Nsp1, komórki HEK239T transfekowano plazmidami wyrażającymi pełnej długości WT Nsp1 i formy zmutowane z delecjami.Profile transkryptomów każdej traktowanej komórki HEK239T poddano obróbce do analizy PCA, wykazując, że mutanty delecyjne skupiały się stosunkowo bliżej i znacząco różniły się od WT Nsp1.Geny, których ekspresja była znacząco zwiększona w mutantach, zostały głównie wzbogacone w „proces biosyntezy/metabolizmu peptydów”, „biogenezę kompleksu rybonukleoproteinowego”, „ukierunkowanie białka na błonę/ER” itp. Co więcej, dwie delecje wykazały odrębny wzór ekspresji z WT.
Rycina 4. Analiza transkryptomu komórek HEK239T transfekowanych WT Nsp1 i tych z delecjami
W badaniu dotyczącym nadekspresji IFN-1 zbadano także wpływ delecji na odpowiedź IFN-1.Wykazano, że wszystkie testowane delecje zmniejszają odpowiedź IFN-1 w transfekowanych komórkach HEK239T i A549 zarówno na poziomie transkryptomu, jak i na poziomie białka.Co ciekawe, geny o znacząco obniżonej delecji zostały wzbogacone o „odpowiedź obronną na wirusa”, „replikację genomu wirusa”, „regulację transkrypcji przez polimerazę RNA II” i „odpowiedź na interferon typu I”.
Rycina 5. Regulacja w dół szlaków sygnalizacji interferonu u mutanta ∆500-532
W tym badaniu wpływ tych delecji na wirusa potwierdzono dodatkowo w badaniach nad infekcjami wirusowymi.Z próbek klinicznych wyizolowano wirusy z pewnymi mutantami i zakażono komórki Calu-3.Szczegółowe wyniki badań nad infekcjami wirusowymi można przeczytać w artykule.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Odniesienie
Lin J., Tang C., Wei H. i in.Monitorowanie genomu SARS-CoV-2 odkrywa wariant delecji Nsp1, który moduluje odpowiedź interferonu typu I [J].Gospodarz komórkowy i drobnoustrój, 2021.
Wiadomości i najważniejsze informacje ma na celu podzielenie się najnowszymi pomyślnymi przypadkami z firmą Biomarker Technologies, uchwycenie nowatorskich osiągnięć naukowych, a także wybitnych technik zastosowanych podczas badania.
Czas publikacji: 06 stycznia 2022 r