TAWO NGA GENOMICS
genetics sa kinaiyahan
Ang long-read sequencing nagpaila sa GGC repeat expansions sa NOTCH2NLC nga may kalabutan sa neuronal intranuclear inclusion disease
ONT resequencing |Illumina |Tibuok exome sequencing |CRISPR-Cas9 ONT nga gipunting nga pagkasunodsunod |RNA-seq |ONT 5mC methylation nga pagtawag
Mga highlight
1. Pinaagi sa pag-analisa sa Linkage sa usa ka dako nga pamilya sa NIID, duha ka nalambigit nga rehiyon ang giila.
2.ONT-based long-read sequencing ug Cas-9 mediated enrichment Ang ONT sequencing nakadiskobre ug potensyal nga genetic nga hinungdan sa NIID, GGC repeat expansions sa 5′ UTR sa NOTCH2NLC.Gi-report sa kini nga pagtuon ang pagbalik-balik nga pagpalapad sa mga gene nga piho sa tawo sa unang higayon nga milambo pinaagi sa mga pagdoble sa segmental.
Ang 3.RNA sequencing nagpadayag abnormal antisense transcripts sa sinugdanan o sa sulod sa GGC repeat expansion rehiyon sa NOTCH2NLC.
Background
NAng euronal intranuclear inclusion disease (NIID) usa ka progresibo ug makamatay nga sakit nga neurodegenerative, nga gihulagway sa presensya sa eosinophilic hyaline intranuclear inclusions sa sentral ug peripheral nga sistema sa nerbiyos.Ang labi ka mabag-o nga klinikal nga pagpakita niini nagpatunghag daghang mga kalisud sa pagdayagnos hangtod sa pagpaila sa biopsy sa panit.Bisan pa, ang mga pamaagi nga nakabase sa histopathology nag-antos gihapon sa misdiagnosis, nga nanginahanglan usa ka genetic nga pagsabut sa NIID.
Mga nahimo
Pagtuki sa Linkage
SAng hort-read sequencing base sa tibuok genome sequencing (WGS) ug tibuok exome sequencing (WES) gihimo sa usa ka dako nga pamilya sa NIID (13 nga apektado ug 7 nga wala maapektuhan nga mga miyembro).Ang pag-analisa sa linkage sa mga SNP nga gikuha gikan niini nga mga datos nagpadayag sa duha lamang ka nalambigit nga mga rehiyon: usa ka 3.5 Mb nga rehiyon sa 1p36.31-p36.22 (maximum LOD = 2.32) ug usa ka 58.1 Mb nga rehiyon sa 1p22.1-q21.3 (maximum LOD: 4.21 ).Bisan pa, wala’y nakit-an nga mga pathogenic SNP o CNV sa kini nga nalambigit nga mga rehiyon.
GGC balik-balik nga pagpalapad sa NOTCH2NLC
NAng anopore-based sequencing giproseso sa 13 ka apektado ug 4 ka wala maapektuhan nga mga miyembro gikan sa 8 ka pamilya (laing naapektuhan nga miyembro gisunod-sunod sa Pacbio long read sequencing platform.).Ang dugay nga pagbasa nga datos nagpadayag sa sakit nga may kalabutan sa GGC nga gisubli nga pagpalapad sa 5′ UTR sa NOTCH2NLC gene mapping ngadto sa 58.1 Mb nga nalambigit nga rehiyon (Figure 1).Kini nga mga balik-balik nga pagpalapad giila usab sa tanan nga 40 ka sporadic NIID nga mga kaso nga gisulayan sa RP-PCR.
CAng as-9 nga gipataliwala nga pagsunud sa target sa nanopore platform gigamit aron makab-ot ang mas taas nga pagsakup sa pagbasa sa NOTCH2NLC nga gisubli (100 X-1,795 X).Kini nga mga han-ay sa consensus miuyon pag-ayo sa mga nauna nga mga nahibal-an sa mga pag-usab sa GGC.Dugang pa, ang {(GGA) n (GGC) n}n gisubli giila isip usa ka potensyal nga genetic marker alang sa kahuyang-dominant phenotype (Figure 2).
Figure 1. Sakit nga nalangkit sa pagbalik-balik nga pagpalapad giila sa exon 1 sa NOTCH2NLC isoforms.
Figure 2. Consensus sequences sa NPTCH2NLC nga gisubli sa mga pasyente sa NIID nga adunay(*) o walay kahuyang-dominant phenotype
NAng mga gene sa OTCH2NL kay mga gene nga espesipiko sa tawo, nga gituohan nga adunay hinungdanon nga papel sa ebolusyon sa utok sa tawo ug mga sakit sa neurological.Bisan pa, tulo ka mga gene nga may kalabutan sa NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB ug NOTCH2NLC) nga adunay> 99.1% nga pagkakasunud-sunod nga pagkakakilanlan wala masulbad hangtod sa labing bag-o nga asembliya sa genome sa tawo.Ang synthesis-free ug long-read sequencing sa nanopore platform nagpakita ug talagsaong mga bentaha sa pagsulbad sa mga rehiyon nga taas ang pagkaparehas ug (GGC) n nga gisubli nga adunay 100% GC-rich.
GGC balik-balik nga pagpalapad sa NOTCH2NLC
TAng ranscriptome sequencing giproseso sa 2 nga apektado ug 2 nga wala maapektuhan nga mga miyembro.Ang normalized nga giladmon sa pagbasa gikalkulo sa sense ug antisense strands sa upstream sa unang mga exon sa NOTCH2NL paralogs.Ang dili normal nga anti-sense transcripts nakit-an lamang sa mga apektadong kaso, nga naglingkod sa sinugdanan o sa sulod sa repeat expansion region (Purple peaks sa F1-14 ug F1-16 sa Figure 3.).Dugang pa, ang 54 DEGs giila ug ang tanan gipadato sa GO ug MPO nga mga termino nga may kalabutan sa neuronal functions.
Figure 3. Na-normalize ang giladmon sa pagbasa sa upstream sa unang exon sa NOTCH2NLC sa wala maapektuhan (ibabaw) ug apektado (ubos) nga mga kaso.
Teknolohiya
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
NAng anopore sequencing nagpalahi sa iyang kaugalingon gikan sa ubang mga sequencing platform, tungod kay ang mga nucleotide direktang gibasa nga walay proseso sa DNA synthesis.Samtang ang usa ka strand nga DNA moagi sa usa ka nano-sized nga protina pore (nanopore), ang lain-laing mga nucleotide makamugna og lain-laing mga ionic nga sulog, nga mahimong makuha ug ibalhin ngadto sa han-ay sa mga base.Ang ONT sequencing platform mismo wala magpakita sa dayag nga teknikal nga limitasyon sa gitas-on sa pagbasa sa DNA.Busa, ang mga Ultra-long reads (ULRs) magamit alang sa genome nga asembliya nga adunay taas nga kalidad.Dugang pa, kining hilabihan ka taas nga mga pagbasa, nga igo ang gitas-on aron makatabok sa komplikado nga mga bahin sa pagkasunod-sunod o pagkalainlain sa istruktura, makatabang sa pagbuntog sa mga limitasyon sa mubo nga pagbasa nga pagkasunod-sunod dinhi.
Pagsunud sa Nanopore
Structure variation (SV) identification
SAng ynthesis-free sequencing kadaghanan nagpreserbar sa impormasyon sa DNA methylation sa template.Ang methylated A, T, C ug G makamugna og lahi nga ionic nga mga sulog gikan sa mga un-methylated, nga direktang mabasa sa plataporma.Ang pagsunud sa Nanopore naghatag gahum sa tibuuk nga genome profiling sa parehas nga 5mC ug 6mA sa resolusyon nga single-nucleotide.
Reperensya
Jun Sone, et.al.Ang dugay nga pagbasa nga pagkasunodsunod nagpaila sa GGC nga gisubli nga pagpalapad sa NOTCH2NLC nga may kalabutan sa neuronal intranuclear inclusion disease.Nature Genetics (2019)
Tech ug Highlight nagtumong sa pagpaambit sa pinakabag-o nga malampuson nga aplikasyon sa lain-laing mga high-throughput sequencing nga mga teknolohiya sa nagkalain-laing reseach arena ingon man usab sa hayag nga mga ideya sa eksperimental nga disenyo ug data mining.
Oras sa pag-post: Ene-06-2022