GIZA GENOMIKA
naturaren genetika
Irakurketa luzeko sekuentziazioak GGC errepikapen hedapenak identifikatzen ditu NOTCH2NLCn barne-nuklear barneko neurona-gaixotasunarekin lotutako
ONT birsekuentziazioa |Illumina |Exoma osoko sekuentziazioa |CRISPR-Cas9 ONT zuzendutako sekuentziazioa |RNA-sekuentzia |ONT 5mC metilazio-deia
Nabarmenak
1. NIID familia handi baten Lotura-analisiaren bidez, lotuta dauden bi eskualde identifikatu ziren.
2.ONT-en oinarritutako irakurketa luzeko sekuentziazioak eta Cas-9 bidezko aberaspena ONT sekuentziazioak NIID-en kausa genetiko potentziala aurkitu zuen, GGC errepikatu hedapenak NOTCH2NLCren 5′ UTRn.Azterketa honek gizakiaren espezifikoen geneetan errepikatutako hedapenen berri eman zuen lehen aldiz, bikoizketa segmentuen bidez eboluzionatu zutenak.
3.RNA sekuentziatzeak zentzuaren aurkako transkripzio anormalak agerian utzi zituen hasieran edo GGC errepikatu hedapen-eskualdeen barruan NOTCH2NLCn.
Aurrekariak
Neuronal barnenuklear inklusioaren gaixotasuna (NIID) gaixotasun neuroendekapenezko progresibo eta hilgarria da, eta nerbio-sistema zentralean eta periferikoetan inklusio intranuklear hialino eosinofilikoen presentzia da.Bere agerpen kliniko oso aldakorrek zailtasun handiak sortzen dituzte larruazaleko biopsia sartu arte diagnostikatzeko.Hala ere, histopatologian oinarritutako metodoek diagnostiko okerrak jasaten dituzte oraindik, eta horrek NIIDaren ulermen genetikoa eskatzen du.
Lorpenak
Loturaren analisia
SHort-read sekuentziazioan oinarritutako genoma osoko sekuentziazioa (WGS) eta exoma osoko sekuentziazioa (WES) NIID familia handi batean (13 kaltetutako eta 7 kaltetu gabeko kide) egin ziren.Datu horietatik ateratako SNP-en lotura-analisiak loturiko bi eskualde baino ez ditu agerian utzi: 3,5 Mb-ko eskualdea 1p36.31-p36.22-n (gehienezko LOD=2.32) eta 58.1 Mb-ko eskualdea 1p22.1-q21.3-n (gehienezko LOD: 4.21). ).Hala ere, ez zen SNP edo CNV patogenorik identifikatu lotuta dauden eskualde horietan.
GGC errepikatu hedapenak NOTCH2NLCn
Nanoporetan oinarritutako sekuentziazioa 8 familietako kaltetutako 13 eta kaltetu gabeko 4 kidetan prozesatu zen (eragindako beste kide bat Pacbio luze irakurritako sekuentziazio plataformak sekuentziatu zuen).Luze irakurritako datuek gaixotasunarekin lotutako GGC errepikatzen duten hedapenak agerian utzi zituzten NOTCH2NLC genearen 5′ UTR-an 58,1 Mb-ko loturiko eskualdean (1. Irudia).Errepikatu hedapen hauek RP-PCRk probatutako 40 NIID kasu esporadikoetan ere identifikatu ziren.
Cnanoporo plataforman as-9 bidezko xede-sekuentziazioa erabili zen NOTCH2NLC errepikapenean irakurketa-estaldura handiagoa lortzeko (100 X-1.795 X).Adostasun-sekuentzia hauek ondo ados zeuden GGC errepikapenen hedapenei buruzko aurreko aurkikuntzekin.Gainera, {(GGA)n (GGC)n}n errepikapenak ahultasuna nagusi den fenotipoaren markatzaile genetiko potentzial gisa identifikatu ziren (2. Irudia).
1. irudia. NOTCH2NLC isoformen 1. exoian identifikatutako gaixotasunari lotutako errepikapen hedapena.
2. Irudia. NPTCH2NLCren adostasun-sekuentziak errepikatzen dira NIID pazienteetan(*) edo ahultasun nagusiko fenotiporik gabe.
NOTCH2NL geneak giza-gene espezifikoak dira, eta uste da ezinbestekoa dutela gizakiaren garunaren bilakaeran eta gaixotasun neurologikoetan.Hala ere, %99,1eko sekuentzia-identitatea duten hiru NOTCH2 gene (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB eta NOTCH2NLC) ez ziren ebatzi giza genomaren azken muntaketa arte.Sintesirik gabeko eta irakurketa luzeko sekuentziazioak nanoporoen plataforman abantaila nabarmenak erakutsi ditu antzekotasun handiko eskualdeak eta (GGC)n errepikapenak % 100 GC aberatsa duten eskualdeak ebazteko.
GGC errepikatu hedapenak NOTCH2NLCn
Transcriptome sekuentziazioa kaltetutako 2 kidetan eta kaltetu gabeko 2tan prozesatu zen.Irakurketa-sakonera normalizatua NOTCH2NL paralogoen lehen exoien gorako zentzumen eta antisentipen-kateetan kalkulatu zen.Zentzuaren aurkako transkripzio anormalak kaltetutako kasuetan bakarrik aurkitu ziren, hasieran edo errepikatutako hedapen-eskualdearen barruan kokatzen direnak (Purple gailur F1-14 eta F1-16 3. Irudian).Horrez gain, 54 DEG identifikatu ziren eta guztiak funtzio neuronalekin lotutako GO eta MPO terminoetan aberastu ziren.
3. Irudia. Irakurketa-sakonera normalizatua NOTCH2NLC-ren lehen exoitik gorako eraginik gabeko (goian) eta kaltetutako (behean) kasuetan.
Teknologia
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nanoporen sekuentziazioa beste sekuentziazio plataformetatik bereizten da, izan ere, nukleotidoak zuzenean irakurtzen dira DNA sintesi prozesurik gabe.Kate bakarreko DNA bat nano-tamainako proteina-poro (nanoporo) batetik igarotzen den heinean, nukleotido ezberdinek korronte ioniko desberdinak sortzen dituzte, eta horiek harrapatu eta baseen sekuentziara transferi daitezke.ONT sekuentziazio plataformak berak ez du DNAren irakurketaren iraupenaren itxurazko muga teknikorik erakusten.Beraz, irakurketa ultraluzeak (ULR) eskuragarri daude kalitate handiko genomaren muntaketa egiteko.Gainera, irakurketa oso luze hauek, sekuentzia-ezaugarri konplexuak edo egitura-aldakuntzak zeharkatzeko nahikoa luzeak, irakurketa laburreko sekuentziazioaren mugak gainditzen laguntzen dute hemen.
Nanoporoen sekuentziazioa
Egitura-aldakuntza (SV) identifikazioa
Ssintesirik gabeko sekuentziazioak ADNaren metilazio-informazioa gorde zuen txantiloian.A, T, C eta G metilatuek korronte ioniko desberdinak sortzen dituzte ez-metilatuetatik, eta plataformak zuzenean irakur ditzake.Nanoporoen sekuentziazioak genoma osoko profilak ahalbidetzen ditu nukleotido bakarreko bereizmenean, bai 5mC bai 6mA.
Erreferentzia
Jun Sone, et.al.Irakurketa luzeko sekuentziazioak GGC errepikapen hedapenak identifikatzen ditu NOTCH2NLC-n, inklusio barneko neurona-gaixotasunarekin lotutako.Naturaren Genetika (2019)
Teknologia eta Nabarmenak Errendimendu handiko sekuentziazio-teknologia desberdinen azken aplikazio arrakastatsuena partekatzea du helburu hainbat ikerketa-esparrutan, baita diseinu esperimentaleko eta datu-meatzaritzako ideia bikainak ere.
Argitalpenaren ordua: 2022-06-06