MENNESKELIG GENOMI
naturgenetik
Langlæst sekventering identificerer GGC-gentagelsesudvidelser i NOTCH2NLC forbundet med neuronal intranukleær inklusionssygdom
ONT gensekventering |Illumina |Hel exome sekventering |CRISPR-Cas9 ONT målrettet sekventering |RNA-seq |ONT 5mC methyleringskald
Højdepunkter
1. Ved koblingsanalyse på en stor NIID-familie blev to forbundne regioner identificeret.
2.ONT-baseret langlæst sekventering og Cas-9-medieret berigelse ONT-sekventering opdagede en potentiel genetisk årsag til NIID, GGC-gentagelsesudvidelser i 5′ UTR af NOTCH2NLC.Denne undersøgelse rapporterede gentagne udvidelser i menneskespecifikke gener for første gang, der udviklede sig gennem segmentelle duplikationer.
3.RNA-sekventering afslørede unormale antisense-transkripter i begyndelsen eller inde i GGC-gentagelsesudvidelsesregioner i NOTCH2NLC.
Baggrund
Neuronal intranuclear inclusion disease (NIID) er en progressiv og dødelig neurodegenerativ sygdom, som er karakteriseret ved tilstedeværelsen af eosinofile hyalin intranukleære inklusioner i det centrale og perifere nervesystem.Dens meget varierende kliniske manifestationer rejser store vanskeligheder med diagnosticering indtil introduktion af hudbiopsi.Imidlertid lider histopatologi-baserede metoder stadig af fejldiagnosticering, hvilket kræver en genetisk forståelse af NIID.
Præstationer
Sammenhængsanalyse
Short-read sekventering baseret hele genom sekventering (WGS) og hele exome sekventering (WES) blev udført på en stor NIID familie (13 berørte og 7 upåvirkede medlemmer).Koblingsanalyse på SNP'er ekstraheret fra disse data afslørede kun to forbundne regioner: en 3,5 Mb region ved 1p36.31-p36.22 (maksimal LOD=2.32) og en 58.1 Mb region ved 1p22.1-q21.3 (maksimal LOD: 4.21 ).Imidlertid blev ingen patogene SNP'er eller CNV'er identificeret i disse forbundne regioner.
GGC gentage udvidelser i NOTCH2NLC
Nanopore-baseret sekventering blev behandlet på 13 berørte og 4 upåvirkede medlemmer fra 8 familier (et andet berørt medlem blev sekventeret af Pacbio long read sekventeringsplatform.).Langlæste data afslørede sygdomsassocierede GGC-gentagelsesudvidelser i 5′ UTR af NOTCH2NLC-genkortlægning til 58,1 Mb koblet region (figur 1).Disse gentagne udvidelser blev også identificeret i alle 40 sporadiske NIID tilfælde testet ved RP-PCR.
Cas-9-medieret målsekventering på nanopore-platform blev anvendt til at opnå højere læsedækning på NOTCH2NLC-gentagelse (100 X-1.795 X).Disse konsensussekvenser stemte godt overens med tidligere resultater om GGC-gentagelsesudvidelser.Desuden blev {(GGA)n (GGC)n}n gentagelser identificeret som en potentiel genetisk markør for svaghedsdominant fænotype (figur 2).
Figur 1. Sygdomsassocieret gentagelsesudvidelse identificeret på exon 1 af NOTCH2NLC isoformer.
Figur 2. Konsensussekvenser af NPTCH2NLC-gentagelse i NIID-patienter med(*) eller uden svaghedsdominant fænotype
NOTCH2NL gener er menneskespecifikke gener, som menes at spille en afgørende rolle i menneskelig hjerneudvikling og neurologiske sygdomme.Imidlertid blev tre NOTCH2-relaterede gener (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB og NOTCH2NLC) med >99,1% sekvensidentitet ikke løst før den seneste humane genomsamling.Syntesefri og langlæst sekventering på nanopore-platform har vist bemærkelsesværdige fordele ved at løse områder med høj lighed og (GGC)n-gentagelser med 100% GC-rige.
GGC gentage udvidelser i NOTCH2NLC
Transcriptom-sekventering blev behandlet på 2 berørte og 2 upåvirkede medlemmer.Normaliseret læsedybde blev beregnet på sense- og antisense-strenge opstrøms for de første exoner af NOTCH2NL-paraloger.Unormale anti-sense-transkripter blev kun fundet i afficerede tilfælde, som sidder i begyndelsen eller inde i den gentagne ekspansionsregion (lilla toppe i F1-14 og F1-16 i figur 3.).Derudover blev 54 DEG'er identificeret, og alle blev beriget i GO- og MPO-termer relateret til neuronale funktioner.
Figur 3. Normaliseret læsedybde opstrøms for den første exon af NOTCH2NLC i upåvirkede (ovenfor) og påvirkede (nedenfor) tilfælde.
Teknologi
Oxford Nanopore Tekhnologies (ONT)
Nanopore-sekventering adskiller sig fra andre sekventeringsplatforme, ved at nukleotiderne aflæses direkte uden DNA-synteseproces.Når et enkeltstrenget DNA passerer gennem en proteinpore i nanostørrelse (nanopore), genererer forskellige nukleotider forskellige ionstrømme, som kan fanges og overføres til sekvenser af baser.ONT-sekventeringsplatformen i sig selv viser ikke tilsyneladende teknisk grænse for længden af DNA-aflæsning.Derfor er ultralange læsninger (ULR'er) tilgængelige til genomsamling af høj kvalitet.Desuden hjælper disse ekstremt lange læsninger, som er lange nok til at krydse komplekse sekvensfunktioner eller strukturel variation, med at overvinde begrænsningerne ved kortlæst sekvensering her.
Nanopore sekventering
Identifikation af strukturvariation (SV).
Syntesefri sekventering bevarede stort set DNA-methyleringsinformation på template.Methylerede A, T, C og G genererer forskellige ionstrømme fra ikke-methylerede, som kan aflæses direkte af platformen.Nanopore-sekventering giver mulighed for hel-genomprofilering af både 5mC og 6mA ved enkeltnukleotidopløsning.
Reference
Jun Sone, et.al.Langlæst sekventering identificerer GGC-gentagelsesudvidelser i NOTCH2NLC forbundet med neuronal intranukleær inklusionssygdom.Naturgenetik (2019)
Teknologi og højdepunkter sigter på at dele den seneste succesfulde anvendelse af forskellige high-throughput sekventeringsteknologier i forskellige forskningsarenaer samt geniale ideer inden for eksperimentelt design og datamining.
Indlægstid: Jan-06-2022