ГЕНОМІКА ЛЮДИНИ
генетика природи
Секвенування тривалого зчитування визначає розширення повторів GGC у NOTCH2NLC, пов’язане із захворюванням нейронального внутрішньоядерного включення
ОНТ переупорядкування |Illumina |Секвенування всього екзому |Цільове секвенування CRISPR-Cas9 ONT |РНК-послідовність |Виклик метилювання ONT 5mC
Основні моменти
1. За допомогою аналізу зв’язків у великій родині NIID було ідентифіковано дві пов’язані області.
2. Секвенування тривалого зчитування на основі ONT і збагачення, опосередковане Cas-9. Секвенування ONT виявило потенційну генетичну причину NIID, розширення повторів GGC у 5′ UTR NOTCH2NLC.У цьому дослідженні вперше повідомлено про повторні експансії в людських специфічних генах, які еволюціонували через сегментарні дуплікації.
3. Секвенування РНК виявило аномальні антисмислові транскрипти на початку або всередині областей розширення повторів GGC у NOTCH2NLC.
Фон
NХвороба внутрішньоядерних включень (НЗЯ) є прогресуючою та летальною нейродегенеративною хворобою, яка характеризується наявністю еозинофільних гіалінових внутрішньоядерних включень у центральній та периферичній нервовій системах.Дуже варіабельні клінічні прояви викликають значні труднощі в діагностиці аж до впровадження біопсії шкіри.Однак методи, засновані на гістопатології, все ще страждають від помилкових діагнозів, що вимагає генетичного розуміння NIID.
Досягнення
Аналіз зв'язків
SСеквенування повного генома (WGS) і повного екзома (WES) було виконано на великій родині NIID (13 уражених і 7 неуражених членів).Аналіз зв’язків на SNP, отриманих із цих даних, виявив лише дві пов’язані області: область 3,5 Мб на 1p36.31-p36.22 (максимальний LOD=2,32) і область 58,1 Мб на 1p22.1-q21.3 (максимальний LOD: 4,21). ).Однак у цих пов’язаних областях не виявлено патогенних SNP або CNV.
Повторні розширення GGC у NOTCH2NLC
NСеквенування на основі анопор було оброблено на 13 уражених і 4 неуражених членах із 8 сімей (іншого ураженого члена було секвеновано за допомогою платформи довгозчитуваного секвенування Pacbio).Дані тривалого зчитування показали розширення повторів GGC, пов’язаних із захворюванням, у 5′ UTR відображення гена NOTCH2NLC у зв’язану область 58,1 Mb (рис. 1).Ці повторні розширення також були виявлені у всіх 40 спорадичних випадках NIID, протестованих за допомогою RP-PCR.
Cas-9 опосередковане цільове секвенування на нанопористій платформі використовувалося для досягнення вищого охоплення зчитування на повторі NOTCH2NLC (100 X-1795 X).Ці консенсусні послідовності добре узгоджуються з попередніми висновками щодо повторних розширень GGC.Крім того, повтори {(GGA)n (GGC)n}n були ідентифіковані як потенційний генетичний маркер фенотипу з домінантним ослабленням (рис. 2).
Рисунок 1. Повторна експансія, пов’язана із захворюванням, ідентифікована в екзоні 1 ізоформ NOTCH2NLC.
Рисунок 2. Консенсусні послідовності повтору NPTCH2NLC у пацієнтів з NIID з (*) або без домінантного фенотипу
NГени OTCH2NL є специфічними для людини генами, які, як вважають, відіграють життєво важливу роль в еволюції людського мозку та неврологічних захворюваннях.Однак три пов’язані з NOTCH2 гени (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB і NOTCH2NLC) з ідентичністю послідовності >99,1% не були розкриті до останнього складання геному людини.Секвенування без синтезу та тривалого зчитування на нанопоровій платформі продемонструвало помітні переваги в розділенні областей високої подібності та повторів (GGC)n зі 100% насиченим GC.
Повторні розширення GGC у NOTCH2NLC
Tсеквенування ранкриптому було оброблено на 2 уражених і 2 неуражених членах.Нормалізована глибина зчитування була розрахована на сенсових і антисмислових ланцюгах вище перших екзонів паралогів NOTCH2NL.Аномальні антисмислові транскрипти були виявлені лише в уражених випадках, які розташовані на початку або всередині ділянки повторного розширення (фіолетові піки в F1-14 і F1-16 на малюнку 3.).Крім того, було ідентифіковано 54 DEG, і всі вони були збагачені термінами GO та MPO, пов’язаними з функціями нейронів.
Малюнок 3. Нормована глибина зчитування вище за перший екзон NOTCH2NLC у неураженому (вище) та ураженому (нижче) випадках.
технології
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nанопорне секвенування відрізняється від інших платформ секвенування тим, що нуклеотиди зчитуються безпосередньо без процесу синтезу ДНК.Коли один ланцюг ДНК проходить через білкову пору нанорозміру (нанопору), різні нуклеотиди генерують різні іонні струми, які можуть бути захоплені та передані в послідовність основ.Сама платформа секвенування ONT не демонструє явних технічних обмежень щодо тривалості зчитування ДНК.Таким чином, ультрадовгі зчитування (ULR) доступні для складання геному високої якості.Крім того, ці надзвичайно довгі зчитування, які є достатньо довгими, щоб перетнути складні особливості послідовності або структурні варіації, допомагають подолати обмеження секвенування короткого зчитування.
Секвенування нанопор
Ідентифікація зміни структури (SV).
SСеквенування без синтезу значною мірою зберегло інформацію про метилювання ДНК на матриці.Метильовані A, T, C і G генерують різні іонні струми від неметильованих, які можна зчитувати безпосередньо платформою.Секвенування нанопор дає змогу профілювати весь геном як 5 мК, так і 6 мА з роздільною здатністю одного нуклеотиду.
довідка
Джун Соне та ін.al.Секвенування тривалого зчитування ідентифікує розширення повторів GGC у NOTCH2NLC, пов’язане із захворюванням нейронального внутрішньоядерного включення.Природна генетика (2019)
Техніка та основні моменти має на меті поділитися найновішим успішним застосуванням різних високопродуктивних технологій секвенування в різних дослідницьких сферах, а також блискучими ідеями в експериментальному дизайні та аналізі даних.
Час публікації: 06 січня 2022 р