HUMAN GENOMI
naturgenetik
Långläst sekvensering identifierar GGC upprepade expansioner i NOTCH2NLC associerade med neuronal intranukleär inklusionssjukdom
ONT omsekvensering |Illumina |Hel exome-sekvensering |CRISPR-Cas9 ONT riktad sekvensering |RNA-seq |ONT 5mC metyleringsanrop
Höjdpunkter
1. Genom länkanalys på en stor NIID-familj identifierades två länkade regioner.
2.ONT-baserad långläst sekvensering och Cas-9-medierad anrikning ONT-sekvensering upptäckte en potentiell genetisk orsak till NIID, GGC upprepade expansioner i 5′ UTR av NOTCH2NLC.Denna studie rapporterade upprepade expansioner i mänskliga specifika gener för första gången som utvecklades genom segmentella duplikationer.
3.RNA-sekvensering avslöjade onormala antisens-transkript i början eller inuti GGC-repeterande expansionsregioner i NOTCH2NLC.
Bakgrund
Neuronal intranuclear inclusion disease (NIID) är en progressiv och dödlig neurodegenerativ sjukdom, som kännetecknas av närvaron av eosinofila hyalina intranukleära inneslutningar i centrala och perifera nervsystem.Dess mycket varierande kliniska manifestationer väcker stora svårigheter vid diagnos fram till införandet av hudbiopsi.Histopatologibaserade metoder lider dock fortfarande av felaktig diagnos, vilket kräver en genetisk förståelse av NIID.
Prestationer
Kopplingsanalys
Short-read sekvensering baserad helgenomsekvensering (WGS) och hel exomsekvensering (WES) utfördes på en stor NIID-familj (13 drabbade och 7 opåverkade medlemmar).Kopplingsanalys på SNP: er extraherade från dessa data avslöjade endast två länkade regioner: en 3,5 Mb region vid 1p36.31-p36.22 (maximal LOD=2.32) och en 58.1 Mb region vid 1p22.1-q21.3 (maximal LOD: 4.21) ).Emellertid identifierades inga patogena SNP eller CNV i dessa länkade regioner.
GGC upprepade expansioner i NOTCH2NLC
Nanopore-baserad sekvensering bearbetades på 13 drabbade och 4 opåverkade medlemmar från 8 familjer (en annan påverkad medlem sekvenserades av Pacbio long read sekvenseringsplattform.).Långlästa data avslöjade sjukdomsassocierade GGC upprepade expansioner i 5′ UTR av NOTCH2NLC genmappning till 58,1 Mb länkad region (Figur 1).Dessa upprepade expansioner identifierades också i alla 40 sporadiska NIID-fall som testades med RP-PCR.
Cas-9-medierad målsekvensering på nanopore-plattform användes för att uppnå högre lästäckning på NOTCH2NLC-upprepning (100 X-1 795 X).Dessa konsensussekvenser stämde väl överens med tidigare fynd om GGC upprepade expansioner.Dessutom identifierades {(GGA)n (GGC)n}n upprepningar som en potentiell genetisk markör för svaghetsdominant fenotyp (Figur 2).
Figur 1. Sjukdomsassocierad upprepad expansion identifierad på exon 1 av NOTCH2NLC-isoformer.
Figur 2. Konsensussekvenser av NPTCH2NLC-upprepning i NIID-patienter med(*) eller utan svaghetsdominant fenotyp
NOTCH2NL-gener är mänskliga specifika gener, som tros spela en avgörande roll i människans hjärna och neurologiska sjukdomar.Tre NOTCH2-relaterade gener (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB och NOTCH2NLC) med >99,1% sekvensidentitet löstes dock inte förrän den senaste sammansättningen av mänskligt genom.Syntesfri och långläst sekvensering på nanopore-plattformen har visat betydande fördelar för att lösa regioner med hög likhet och (GGC)n-upprepningar med 100% GC-rika.
GGC upprepade expansioner i NOTCH2NLC
Transkriptomsekvensering bearbetades på 2 påverkade och 2 opåverkade medlemmar.Normaliserat läsdjup beräknades på sens- och antisenssträngar uppströms om de första exonerna av NOTCH2NL-paraloger.Onormala antisense-transkript hittades endast i drabbade fall, som sitter i början eller inuti den upprepade expansionsregionen (lila toppar i F1-14 och F1-16 i figur 3.).Dessutom identifierades 54 grader och alla berikades med GO- och MPO-termer relaterade till neuronala funktioner.
Figur 3. Normaliserat avläsningsdjup uppströms om den första exonen av NOTCH2NLC i opåverkade (ovan) och påverkade (nedan) fall.
Teknologi
Oxford Nanopore Technologies (ONT)
Nanopore-sekvensering skiljer sig från andra sekvenseringsplattformar, genom att nukleotiderna läses direkt utan DNA-syntesprocess.När en enkelsträngad DNA passerar genom en proteinpor i nanostorlek (nanopor), genererar olika nukleotider olika jonströmmar, som kan fångas in och överföras till en sekvens av baser.ONT-sekvenseringsplattformen i sig visar ingen uppenbar teknisk gräns för längden på DNA-läsning.Därför är Ultra-long reads (ULR) tillgängliga för genomsammansättning av hög kvalitet.Dessutom hjälper dessa extremt långa läsningar, som är tillräckligt långa för att korsa komplexa sekvensegenskaper eller strukturella variationer, att övervinna begränsningarna med kortläst sekvensering här.
Nanopore-sekvensering
Identifiering av strukturvariationer (SV).
Syntesfri sekvensering bevarade till stor del DNA-metyleringsinformation på mall.Metylerade A, T, C och G genererar distinkta jonströmmar från icke-metylerade, som kan avläsas direkt av plattformen.Nanopore-sekvensering möjliggör profilering av hela genomet av både 5mC och 6mA vid singelnukleotidupplösning.
Referens
Jun Sone, et.al.Långläst sekvensering identifierar GGC upprepade expansioner i NOTCH2NLC associerade med neuronal intranukleär inklusionssjukdom.Naturgenetik (2019)
Teknik och höjdpunkter syftar till att dela den senaste framgångsrika tillämpningen av olika högkapacitetssekvenseringsteknologier på olika forskningsarenor samt briljanta idéer inom experimentell design och datautvinning.
Posttid: Jan-06-2022